FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ^2+が 、体内のすべての単一のセル内に豊富に見られる非常に重要なイオンで ​​す。それは、成長、増殖、遊走、およびアポトーシス^1-4を含む多くの異なる細胞機能、で重要な役割を持っています。よくのCa ^2+は両方の直接的および間接的な作用を介してこれらのプロセスに影響を与えることができることが確立されているため、このイオンの正常な細胞内濃度の変更が容易に影響を受けた細胞についてのネガティブな結果をもたらすことができます。 SRは、セル⁵内^の最大の細胞内Ca ²⁺ストアとして考えられています。 SRと細胞質の両方におけるCa ²⁺の定常状態レベルは正常にし、この細胞小器官の^の Ca ²⁺ -transportingチャンネルのうち、一定の磁束によって維持されています。損傷または疾患のいずれかの形式に起因する細胞に課さストレスの多い条件は、一般的に、彼に長期的な効果を持っているために行くSRのCa ²⁺の有意な変化と関連していますセルのALTH。例最も深刻で、ストレスを受けた細胞のできないことは、定常状態のSR Caを回復し、維持するため²⁺レベルはあっても、アポトーシス^6-8により死に終わることがあります。

携帯のCa ²⁺動態への現在の研究は、その数少ない研究試験細胞小器官^の Ca ²⁺ストアのコンテンツを直接^9-11事実によって制限されます。最も一般的な方法ではなく、SR ^の Ca ²⁺含有量^12-14の変化の間接的な測定として、細胞質のCa ²⁺レベルの測定を含みます。これらの実験において、 ^の Ca ^2+は、一般的^に細胞小器官の枯渇を引き起こす薬剤（ 例えば、タプシガルジン）の使用を介してSRから放出されるように誘導されます。結論は、その後、細胞質のCa ²⁺濃度の変動に基づいて、SRのCa ²⁺への変更に関連して描かれています。ラウンドアバウトのミリアンペアで、このような結論を導き出すために研究者のための残りの能力にもかかわらず、nner、のCa ²⁺測定SRのこの方法は明らかに収集されたデータの解釈に関する多くの制限で、そのような情報を収集するための間接的な方法です。この明確な制限を回避するためには、SR管腔ネットワーク内で直接見出さ^の Ca ²⁺の量を測定する必要があります。

直接管腔内SRのCa ²⁺レベルを記録することができるというの最終的な結果にバイタルは、細胞培養ツールと使用のCa ²⁺指標です。現在の原稿に参照されるデータについては、使用されたVSMCは、凍結した細胞株からのものであることに注意することが重要です。細胞を、5％CO ₂電源で一定37℃でインキュベート概説した実験用通路22-26上ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％新生仔ウシ血清（NCS）で培養しました。現在の方法を使用して、例えば、細胞が非常にうまく外をシミュレートするタンパク質混合物に成長しました組織¹⁵の多くの異なる種類の環境。 SRのCa ²⁺研究の静脈に沿って成功のための重要なのは、使用されるタンパク質の混合物の一種です。この場合には、低成長因子品種は、通常のCa ²⁺シグナル伝達と絶えず試験された細胞内で起こる動きに影響を与えることから、このツールの構成要素を回避するために必要でした。試験細胞の正常な成長に続いて、のCa ²⁺インジケータも効果的に、これらの培養細胞に導入されなければなりません。これは、SR-在住のCa ²⁺インジケーターD1SRを運ぶアデノウイルスベクターを使用することによって可能となりました。高いトランスフェクション効率を達成するために、細胞は、イメージングの前に、少なくとも36〜48時間のためのウイルスベクターを用いてインキュベートされなければなりません。この調製は、高い精度と再現性でSRルーメン内のCa ²⁺トランジェントを測定するための信頼性の高いツールを提供します。

このプロトコルで使用されるD1SRインジケータはD1ERのCa ^2+、iの修正変異体でありますもともとカリフォルニア大学の博士ロジャー・Y・チエンの研究室、サンディエゴ、USA ^9,16によって作成されたndicator。元D1ERは、前のCa ²⁺指標^9,16に比べてはるかに広い範囲（0.5から160μM）を介してのCa ²⁺感受性を表示カメレオンと呼ばれる遺伝的にコード化され^た Ca ²⁺指標の第二世代に属しています。新しい変種D1SR、博士ウェイン・チェン（アルバータ大学、カナダ）からの親切な贈り物は、しかし、（代わりに元D1ERのように、カルレティキュリンシーケンスの）変異カルセケストリンシーケンスを運びます。変異カルセケストリンは¹¹ルーメンSR内のCa ²⁺に結合する内因性カルセケストリンと競合の問題を解消するのCa ²⁺への結合を減少しています。 D1SRインジケータが変更されたカルモジュリン（CAM）とM13（トンを含むリンカータンパク質によるその結合切り捨て強化シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）を運びます彼のCaM）配列に結合ミオシン軽鎖キナーゼの26残基ペプチド。カムM13配列は、内在性カルモジュリンに結合するM13のを防止するように改変されています。また、SR保持を確実にするために、カルセケストリン配列はCFP ¹¹の5 '末端に追加されています。 Ca ²⁺と結合すると、カムM13ドメインは、FRETシグナル強度の増大として記録され、隣接CFPとYFPとの間のエネルギー伝達の増加をもたらす立体構造変化を経ます。ドロップ²⁺ SR腔のCa濃度は、カムM13ドメインが隣接CFPとYFPの間のエネルギー移動、及びFRETシグナル強度の有意な低下が低下、逆コンフォメーション変化を通過する一方、 。

Protocol

倫理の声明：全ての実験および手順はブリティッシュ・コロンビア州、バンクーバー、カナダの大学の研究室バイオセーフティ指針と一致して行われました。 FRETベースの共焦点顕微鏡のための35ミリメートルのガラス底の培養皿の調製次の手順で36〜48時間前の実験とを使用してプレートを準備します。 Cストレージ-20℃から選択されたゲル状のタンパク質混合物と0.25％?…

Representative Results

このセクションでは、間接的に、細胞質のCaの変動を観察することによっての Ca 2+ストア濃度オルガネラへの変更を測定する一般的に用いられる方法と比較して、SR腔Ca 2+濃度データを捕捉するために記載された方法を用いて得られる結果の例を提供する2+ 。 図1Aは、（514 nm励?…

Discussion

このプロトコルは、SRのルーメン内のCa ²⁺濃度を研究するためにD1SRアデノウイルスとのVSMCのトランスフェクションを説明します。この方法は、異なるカルシウム移動剤を適用した結果に/ SRのうち、直接この細胞小器官内のCa ²⁺の測定だけでなく、その動きを可能にします。この方法は、SRおよび細胞質のCa ²⁺レベルの変化は、全体的な携帯の健康に影響を与えるとどの…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.