배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지
Summary
Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.
Abstract
Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.
Introduction
칼슘은 신체의 모든 단일 세포 내에서 풍부하게 발견되는 매우 중요한 이온입니다. 그것은 성장, 증식, 이동 및 세포 사멸 1-4 등 다양한 세포 기능에 중요한 역할을 가지고있다. 잘 칼슘이 모두 직간접적인 행동을 통해 이러한 프로세스에 영향을 미칠 수 있음을 설립, 따라서,이 이온의 정상적인 세포 내 농도 변화는 쉽게 영향을받는 세포에 대한 부정적인 결과가 발생할 수 있습니다. 스케줄링은 셀 (5) 내에서 가장 큰 세포 내 칼슘 저장소로 간주됩니다. 스케줄링 및 세포질 모두에서 칼슘의 정상 상태 수준은 일반적으로이 세포 기관의 칼슘 수송성 채널 중 일정한 유량을 통해 유지된다. 인한 부상 또는 질병의 형태로 세포에 가해지는 스트레스 조건은 일반적으로 그가 온 오래 지속되는 효과를 가지고 갈 SR 칼슘의 중요한 변화 2+와 관련된셀의 alth. 케이스의 가장 심각한에서 스트레스 셀의 무능력 복구하고 정상 상태 SR의 칼슘을 유지 2+ 수준도 사멸 6-8으로 사망 절정에 달하다 수 있습니다.
세포의 칼슘 역학에 대한 현재의 연구는 몇몇 연구 시험 칼슘 저장소의 콘텐츠를 직접 9-11 세포 기관 있다는 사실에 의해 제한된다. 가장 일반적인 방법은 대신 SR 칼슘 함량 12-14에서 변화의 간접적 인 측정과 같은 세포 내 칼슘 수준의 측정을 포함한다. 이 실험에서, 칼슘은 일반적으로 세포 소기관의 고갈을 초래되는 약물 (예 쌥시 가르 긴)의 사용을 통해 SR로부터 방출되도록 유도된다. 결론은 다음 세포질 칼슘 농도의 변동에 따라 SR 칼슘의 변경과 관련하여 그려집니다. 로터리 엄마에 같은 결론을 도출하기 위해 연구자 남은 능력에도 불구하고nner, SR 칼슘 측정이 방법은 수집 된 데이터의 해석에 관한 많은 제한과 같은 정보를 수집합니다 할 수있는 간접적 인 방법은 분명히있다. 이 명확한 제한을 우회시키기 위해서는, SR 내강 네트워크 내에서 직접 발견 칼슘의 양을 측정 할 필요가있다.
직접 관내 SR 칼슘 수준을 기록 할 수있는의 최종 결과에 필수적은 세포 배양 용 공구 및 사용되는 칼슘 지표이다. 현재의 논문에 언급 된 데이터의 경우, 사용되는 혈관 평활근 세포는 냉동 세포주로부터 왔다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 세포는 5 % CO 2 공급 일정 37 ° C에서 배양 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) +를 설명 실험 구절 22-26을 통해 10 %의 신생아 혈청 (NCS)에서 배양 하였다. 현재의 방법을 이용하여, 예를 들어, 세포는 매우 성공적 세포 시뮬레이션 단백질 혼합물에 성장 된조직 (15)의 많은 다른 유형의 환경을 제공합니다. SR 칼슘 정맥 따른 성공에 중요 2+ 연구는 사용 된 단백질 혼합물의 형태이고; 이 경우, 낮은 성장 인자 다양한 일반 칼슘 신호 전달에 영향을주는 동작과 끊임없이 시험 셀 내에서 발생하는이 도구의 부품을 피할 필요가 있었다. 시험 셀의 성공적인 성장 후, 칼슘 인디케이터 효과적으로 이러한 배양 세포에 도입한다. 이 SR-상주 칼슘 2+ D1SR 지표를 전달하는 아데노 바이러스 벡터를 이용하여 가능하게되었다. 높은 형질 전환 효율을 달성하기 위해, 셀은 종래 촬상 적어도 36-48 시간 동안 바이러스 벡터와 함께 배양해야한다. 이 제제는 칼슘에게 높은 정확성과 재현성을 가진 SR 루멘 내에서 2 + 과도 전압을 측정 할 수있는 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다.
이 프로토콜에서 사용 D1SR 표시가 D1ER 칼슘의 수정 된 변종이다 2+ 난원래 캘리포니아 대학에서 박사 로저 첸의 실험실, 샌디에고, 미국 9,16에 의해 만들어진 ndicator. 원래 D1ER는 이전 칼슘 2 + 지표 9,16에 비해 훨씬 넓은 범위 (0.5-160 μM)을 통해 칼슘 감도를 표시 cameleons라는 유전자 인코딩 칼슘 지표의 2 세대에 속한다. 새로운 변형 D1SR 박사 웨인 첸 (캐나다 앨버타 대학)에서 일종의 선물은, 그러나, 돌연변이 calsequestrin 시퀀스 (대신 원래 D1ER에서와 같이 칼레 티 큘린 순서)를 수행한다. 돌연변이 calsequestrin는 11 루멘 SR 내에서 칼슘 결합에 내인성 calsequestrin과 경쟁의 문제를 제거 칼슘 결합 감소했다. D1SR 표시등이 잘린 강화 시안 형광 단백질 (CFP)과 노란색 형광 단백질 (YFP) 수정 칼 모듈 린 (CAM) 및 M13을 포함하는 링커 단백질에 의한 바인드 (t을 운반CAM) 시퀀스에 결합 미오신 경쇄 키나제의 그는 26 잔류 물 펩타이드. 캠-M13 순서는 내생 칼 모듈 린 결합에서 M13을 방지하기 위해 수정되었습니다. 또한, SR 유지를 보장하기 calsequestrin 시퀀스 CFP (11)의 5'- 말단에 첨가되었다. 칼슘 이온에 결합 할 때, 캠 M13 도메인은 FRET 신호 강도의 증가로 기록되는 측면 CFP와 YFP 사이의 에너지 전달이 증가 될 구조적 변화를 통해 진행한다. 2+ SR 내강 칼슘의 농도가 떨어질 때 한편, 캠 M13 도메인은 측면 CFP 및 YFP 및 FRET 신호 강도의 현저한 저하의 에너지 전달의 감소를 초래 역방향 구조적 변화를 통해 진행 .
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 SR의 루멘 내 칼슘 농도를 연구하기 D1SR 아데노 바이러스와 혈관 평활근 세포의 형질을 설명합니다. 이 방법은 직접이 소기관 내 칼슘의 측정뿐만 아니라 다른 칼슘 이동 에이전트 애플리케이션의 결과로서 SR 만점으로의 이동 / 허용한다. 이 방법은 SR과 세포질 칼슘 수준에 변화가 전체 세포의 건강에 영향을 미칠 어떻게 이러한 변화는 상호 관련있는 방법?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 [CVB & ME에 MOP-1112666] 건강 연구의 캐나다 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate) | Life technologies | 11995-065 | Warm in 37°C water bath before use |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL | Corning | 356230 | Keep at -20°C until right before use |
| Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | Keep at -20°C until right before use | |
| 35mm glass-bottomed plates | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| 250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask | BD Falcon | 353136 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Life technologies | 25200056 | Keep at -20°C until right before use |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | BD Falcon | 352070 | |
| D1SR | N/A | N/A | Gift |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Fluo 4-AM | Life technologies | F-23917 | Keep at -20°C until right before use |
| 1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes | Argos Technologies | T7100BK | |
| Leica TCS SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application) | Leica Microsystems | ||
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Software, Inc. |
Referências
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