Измерение флуктуаций кальция в пределах саркоплазматического ретикулума культивируемых клеток гладкой мышцы с использованием FRET на основе конфокальной микроскопии

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ²⁺ является очень важным ионов в изобилии содержится в каждой клетке организма. Она имеет значительную роль во многих различных клеточных функций, в том числе роста, пролиферации, миграции и апоптоза ^1-4. Хорошо известно , что Ca ²⁺ может влиять на эти процессы с помощью прямых и косвенных действий, и , следовательно, изменения в нормальных внутриклеточной концентрации этого иона может легко привести к негативным последствиям для пораженных клеток. SR рассматривается в качестве крупнейшего внутриклеточного Ca ²⁺ магазина в клетке ^5. Устойчивые уровни Са ²⁺ в обоих SR и цитоплазмы , как правило , обеспечивается за счет постоянного потока в и из Са ²⁺ -transporting каналах этой органеллы. Стрессовые условия , наложенные на клетках из – за какой – либо форме травмы или болезни, как правило , связаны со значительными изменениями в SR Ca ²⁺ , которые идут дальше иметь долгосрочные последствия по маршруту онALTH клетки. В наиболее тяжелых случаев, неспособность напряженном клетки для восстановления и поддержания устойчивого состояния SR Ca ²⁺ уровни могут даже высшей точки в смерти путем апоптоза ^6-8.

Современные исследования в клеточной динамики Ca ²⁺ ограничена тем фактом , что несколько исследований тест органельных Ca ²⁺ содержание магазина непосредственно ^9-11. Наиболее распространенной практикой , а не включает в себя измерение цитоплазматических уровней Ca ²⁺ в качестве косвенных измерений изменений в SR содержание ^12-14 Ca ^2+. В этих экспериментах, Ca ²⁺ обычно индуцируется быть освобожден от SR посредством использования фармакологических агентов , вызывающих истощение органеллы (например , тапсигаргин). Выводы затем вытягивают с учетом изменений в SR Ca ²⁺ на основе колебаний в цитоплазматической концентрации Ca ^2+. Несмотря на способность оставшихся для исследователей сделать такие выводы окольным маnner, этот метод SR Ca ²⁺ измерения, несомненно , является косвенным способом почерпнуть такую ​​информацию, со многими ограничениями , касающихся интерпретации собранных данных. Для того чтобы обойти это ограничение четкого, необходимо измерить количество Ca ²⁺ находится непосредственно внутри SR полостной сети.

Жизненно важное значение для окончательного результата имея возможности напрямую записывать внутрипросветное SR уровни Ca ²⁺ являются инструментами для культивирования клеток и индикатор Ca ²⁺ используется. Для данных, упоминаемых в текущей рукописи, важно отметить, что VSMCs используемые происходил из замороженной клеточной линии. Клетки культивировали в среде Игла в модификации Игла (DMEM) + 10% сыворотки новорожденного теленка (NCS) над проходами 22-26 для экспериментов , описанных, инкубирование при постоянной температуре 37 ° С с 5% CO ₂ питания. Используя метод текущего, например, клетки, которые были очень успешно выращивают на белковой смеси, имитирующим внеклеточнойсреда из многих различных типов тканей ^15. Важное значение для успеха вдоль вены SR Ca ²⁺ исследование является тип белковой смеси , используемой; В этом случае, разнообразие низкий фактор роста было необходимо , чтобы избежать компонентов этого инструмента от воздействия на регулярную передачу сигналов Ca ²⁺ и движения постоянно происходят в исследуемом клетках. После успешного роста тестируемых клеток, индикатор Са ²⁺ должен также быть эффективно введены в этих культивированных клеток. Это стало возможным с помощью аденовирусного вектора , который несет SR-проживания Ca ²⁺ индикатор D1SR. Для достижения высокой эффективности трансфекции, клетки должны быть инкубировали с вирусными векторами, по крайней мере 36-48 часов до начала обработки изображений. Этот препарат обеспечивает надежный инструмент для измерения Са ²⁺ в пределах SR просвета с высокой точностью и воспроизводимостью.

D1SR индикатор , используемый в данном протоколе представляет собой модифицированный вариант D1ER Ca ²⁺ яndicator , которая первоначально была создана лаборатория доктора Тсиен в Университете Калифорнии, Сан – Диего, США ^9,16. Оригинальный D1ER принадлежит ко второму поколению генетически кодируемых показателей Ca ²⁺ называемых cameleons , которые показывают чувствительность Ca ²⁺ на гораздо более широкий диапазон (0.5-160 мкм) по сравнению с предыдущими показателями Ca ^{2+ 9,16.} Новый вариант D1SR, своего рода подарок от доктора Уэйна Чен (Университет Альберты, Канада), однако, несет мутантный последовательность calsequestrin (вместо последовательности калретикулин как в оригинале D1ER). Мутант calsequestrin имеет уменьшенное связывание с Са ²⁺ , что устраняет проблему конкуренции с эндогенными calsequestrin связывания с Са ²⁺ в пределах SR просветом ^11. Индикатор D1SR несет усеченный расширение голубого цвета флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), которые связываются с линкерной белком, содержащим модифицированный кальмодулин (CAM) и М13 (тон 26-остаток пептид миозина легкой цепи киназы, который связывается с КУЛАК) последовательностей. Последовательность распредвала M13 была изменена, чтобы предотвратить M13 от связывания с эндогенным кальмодулин. Кроме того , чтобы обеспечить Ретенционный, последовательность calsequestrin была добавлена ​​на конец 5'из CFP ^11. Когда привязан к Са ^2+, домен распредвала М13 проходит через конформационных изменений , которые приводят к увеличению переноса энергии между фланкирующих CFP и YFP, которое регистрируется как увеличение интенсивности сигнала разъедать. С другой стороны, когда концентрация SR полостной Ca ²⁺ падает, домен распредвала М13 проходит через обратные конформационных изменений, что приводит к уменьшению передачи энергии между фланкирующих CFP и YFP, а также значительное падение интенсивности сигнала FRET ,

Protocol

Заявление по этике: Все эксперименты и процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами по биологической безопасности лабораторий Университета Британской Колумбии, Ванкувер, Канада. 1. Подготовка 35 мм со стеклянным дном блюда культуры для FRET основе конфокальной м?…

Representative Results

В этом разделе приведены примеры результатов , которые могут быть получены с помощью описанного метода для захвата SR Ca 2+ просвета концентрации данных, по сравнению с обычно применяемым способом косвенного измерения изменения органелл Ca 2+ концентрации маг…

Discussion

Этот протокол описывает трансфекцию VSMCs с D1SR аденовируса для исследования концентрации Ca ²⁺ в просвете СР. Этот метод позволяет для прямого измерения Са ²⁺ в пределах этой органеллы, а также его перемещения в / из СР в результате применения различных кальциевых движущихся аге?…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.