assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para microdissecção assistida por laser de tipos específicos de células vegetais para perfil transcricional. Embora o protocolo seja adequado para diferentes espécies e tipos de células, o foco está nas células altamente inacessíveis da linha germinativa feminina, importantes para a reprodução sexual e apomítica no gênero de crucíferas Boechera.

Resumo

A compreensão dos processos de desenvolvimento no nível molecular requer insights sobre a regulação transcricional e, portanto, o transcriptoma, no nível de tipos de células individuais. Embora os métodos descritos aqui sejam geralmente aplicáveis a uma ampla gama de espécies e tipos de células, nossa pesquisa se concentra na reprodução de plantas. O cultivo de plantas e a produção de sementes são de importância crucial para a nutrição humana e animal. Uma compreensão detalhada das redes regulatórias que governam a formação da linhagem reprodutiva (linha germinativa) e, em última análise, das sementes é uma pré-condição para a manipulação direcionada da reprodução das plantas. Em particular, a engenharia da apomixia (reprodução assexuada por meio de sementes) em plantas cultivadas promete grandes melhorias, pois leva à formação de sementes clonais geneticamente idênticas à planta-mãe. Consequentemente, os tipos de células da linha germinativa feminina são de grande importância para a compreensão e engenharia da apomixia. No entanto, como as células correspondentes estão profundamente incorporadas nos tecidos florais, elas são muito difíceis de acessar para análises experimentais, incluindo transcriptômica específica do tipo de célula. Para superar essa limitação, seções de células individuais podem ser isoladas por microdissecção assistida por laser (LAM). Embora o LAM em combinação com o perfil transcricional permita a identificação de genes e vias ativas em qualquer tipo de célula com alta especificidade, estabelecer um protocolo adequado pode ser um desafio. Especificamente, a qualidade do RNA obtido após o LAM pode ser comprometida, especialmente quando células pequenas e únicas são direcionadas. Para contornar esse problema, estabelecemos um fluxo de trabalho para LAM que resulta de forma reprodutível em alta qualidade de RNA que é bem adequada para transcriptômica, como exemplificado aqui pelo isolamento de células da linha germinativa feminina em Boechera apomítica. Neste protocolo, são descritos procedimentos para preparo de tecidos e LAM, também no que diz respeito à extração de RNA e controle de qualidade.

Introdução

Em estudos de transcrição feito ao nível dos tecidos, os transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, mas raros são muitas vezes mascarados pelas células vizinhas mais abundantes. Um exemplo para tais tipos de células altamente especializadas são as células da linhagem reprodutor feminino (linha germinal) em plantas. A linha germinal feminina é especificada dentro de óvulos em desenvolvimento, os precursores de sementes no interior do gineceu do ^1,2 flor. O saco embrionário (MMC), é a primeira célula da linha germinativa feminina. Ele sofre meiose para formar uma tétrade de megásporos reduzidos. Tipicamente, apenas uma destas megásporos sob....

Protocolo

Nota: Este protocolo descreve a preparação do tecido, laser assistida microdissection e extração de RNA para o perfil transcricional. Sempre use luvas ao longo de todas as etapas do protocolo. Estudar e considerar as instruções de segurança para cada produto químico utilizado. Em particular, tenha em mente que xilol é prejudicial e pode penetrar luvas e que o metanol é tóxico. Para todos os instrumentos utilizados, consulte os manuais do usuário em conformidade.

1. Remoção de RNAse Atividade de material de vidro e outros equipamentos

1. Antes de usar, envolver qualquer material de vidro em folha de alumínio antes da cozedura para ~ 8 h a 180 ° C para ....

Resultados

Preparação de Amostras e LAM são feitas em etapas consecutivas

Um número de passos consecutivos são necessários para preparar ARN para a análise da transcrição a partir de tipos de células seleccionadas pela LAM (Figura 1). Isto começa com a colheita das flores e a fixação imediata para assegurar que a população de RNA permanece inalterado após a colheita. O tecido é incorporado, em corte, e m.......

Discussão

O protocolo é adequado para celulares diferentes e tipos de tecidos

LAM combinado com transcriptoma analisa por microarrays ou RNA-Seq é uma ferramenta valiosa para obter insights sobre os padrões específicos de atividade dos genes que regulam os processos de desenvolvimento ou fisiológicos ^7-11,13,14. No entanto, a adequação deste método para qualquer dado tipo de célula está criticamente dependente de problemas estruturais. A célula deve ser claramente visível e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Etanol	VWR	1.009.861.000	absoluto EMPROVE Ph Eur, BP, USP
15 ml tubos de centrífuga de falcão	VWR	62406-200
2100 Bioanalisador	Agilent	G2939AA
Ácido Acético	Applichem	A3686,2500	100% Biologia Molecular grau
Ambion Nuclease livre de	água tecnologias	AM9932
ASP200 S	Leica	14048043624	processador de tecidos
papelão			pode ser comprado em papelarias especiais
Lâminas de moldura sem DNA e RNAse	Micro Dissect GmbH		1, 4 µ m PET-membrana; também pode ser comprado na Leica
Dumond Fórceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
lâmpada
exsiccator	Sigma-Aldrich	Z354074-1EA	Nalgene Vaccuum Dessecator ou equipamento similar
pontas de filtro 10  µ l	Axon Lab AG	AL60010	pode ser substituído por pontas semelhantes
de filtro 1.000  µ l	Axon Lab AG	AL60010	pode ser substituído por pontas de
filtro semelhantes 20  µ l	Axon Lab AG	AL60020	pode ser substituído por pontas de filtro de pontas semelhantes
200  µ l	Axon Lab AG	AL60200	pode ser substituído por pontas semelhantes
fórceps de precisão	VWE	232-1221
suporte de lâmina de vidro	Huber & Co.AG	10.0540.01	Fä rbekä Mancha de vidro Hellendahl
através de Huber	& Co.AG	10.0570.01	Fä Módulo
Incorporação de Parafina Aquecida	Leica	Leica EG 1150 H	estação de bloqueio, dispositivos semelhantes são adequados
Mesa de Aquecimento e Secagem	Medax	15501	outros modelos e/ou fornecedores são adequados
balde de	gelo VWR balde de gelo com tampa	10146-184	baldes semelhantes mesa
de luz	UVP Uma empresa analítica Jena	TW-26	transluminador de luz branca
lâmina de microscópio	Thermo Scientific	10143562CE	bordas cortadas
	Thermo Scientific	FEAHS35	lâmina de micrótomo S35 descartável
MMI Cell Cut Plus Instrument	MMI (Molecular Machines and Industries)
Tubos de microfuge antiaderentes, sem RNAse, tecnologias	de vida	de
Paraplast X-TRA	Roth	X882.2	para histologia
Kit de isolamento de RNA PicoPure	tecnologias de vida	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Kit
isolamento bandejas de equilíbrio de plástico	Semadeni AG	2513
caixa de plástico	Semadeni AG	2971	Plastikdose PS
tampa de plástico para placa			agulha de
preparação	VWR	631-7159
RNA 6000 Kit Pico	Agilent	5067-1513
Tubos de microfuga livre de RNAse	life technologies	AM12400
Solução de Descontaminação ZAP de RNAse	life technologies	AM9780
Micrótomo Rotativo Semi-automatizado	Dispositivos semelhantes Leica	RM2245	são igualmente adequados
de tela Tissue Loc Histo	C-1000_AQ Thermo Scientific		semelhantes de outros fornecedores são adequados
Tubos com tampa adesiva, sem difusor 500 µ l	MMI (Molecular Machines and Industries)	50204
Xilol (Isômero) ROTIPURAN	VWR	4436.2	min. 99%, p.a., ACS,
de incorporação de processo	Leica	14039440000	Leica Jet I sem tampa
Forno Universal	Memmert	UF55	outros modelos e/ou fornecedores são adequados

preto de etanol pontas de rbekasten Leica igualmente adequada lâmina de micrótomo de 2 ml AM12475 de de aquecimento caseira ISO SP