Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) som et verktøy for Transkripsjonell Profilering av individuelle celletyper
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
I transkripsjons studier gjort på vevet nivå, er transcriptomes av høyt spesialiserte, men sjeldne celletyper ofte maskert av de mer rikelig omkringliggende cellene. Et eksempel på slike svært spesialiserte celletyper er de cellene i det kvinnelige reproduksjons avstamning (kimlinje) i planter. Den kvinnelige kimcellelinje er spesifisert innenfor utviklings ovules, forløperne til frøene inni gynoecium av blomsten 1,2. Den megaspore morcellen (MMC) er den første cellen i den kvinnelige germline. Det gjennomgår meiose for å danne en tetrad av redusert megaspores. Vanligvis er bare en av disse megaspores overlever og skiller mitotisk uten cytokinese, dvs. i et syncytium. Disse mitoser følges av cellularization for å danne den modne gametofytt, som typisk består av fire celletyper: tre antipodals, to synergid celler, egg, og den sentrale celle. Egg og sentrale celler er de kvinnelige kjønnscellene som blir befruktet av to sædceller under douold befruktning for å gi opphav til embryoet og endosperm av utviklingsland frø 1,2. I den seksuelle modellsystemet Arabidopsis thaliana, bare ~ 50 frø utvikle per blomst mens om lag 50 – 80 frø utvikle per blomst i nært beslektede slekten Boechera. Således, den kvinnelige kimlinje består av bare noen få høyt spesialiserte celletyper, noe som gjør det til et utmerket modell for å studere utviklingsmessige prosesser, slik som celle spesifikasjon og differensiering.
Videre kan innsikt i genet regulatoriske prosesser som styrer anlegget reproduksjon være av anvendt verdi. I planter, kan både seksuell og aseksuell reproduksjon gjennom frø (apomiksis) forekomme. Mens seksuell reproduksjon genererer genetiske mangfoldet i en befolkning, apomiksis fører til dannelsen av klonal avkom som er genetisk identisk med morplanten. Derfor har apomiksis stort potensial for bruk i landbruket og frøproduksjon, som selv komplekse mors genotyper kanopprettholdes uendret over flere generasjoner 3,4,5. Fordi apomiksis ikke naturlig forekommer i noen store avlings arter, er prosjektering av apomiksis i avlinger av stor interesse 3,4,5. Dette er imidlertid et langsiktig mål vanskelig å oppnå fordi den underliggende genetiske og molekylære grunnlaget for apomiksis ikke blir forstått i tilstrekkelig detalj seks.
For å få innsikt i transkripsjons basis styrende småarter reproduksjon, celletype-spesifikke transcriptional profilering ved hjelp av laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) og neste generasjons sekvensering (NGS) representerer et svært kraftig tilnærming 7,8. LAM først har blitt etablert for dyr og biomedisinsk forskning. I de siste årene LAM har også blitt brukt til plantebiologi 6,9,10. I motsetning til andre fremgangsmåter slik at profileringen av individuelle celletyper og vev, ikke LAM ikke krever generering av iletau 6,9,10. Derfor kan det være appløy til en celle eller vevstype uten molekylær kunnskap. En annen fordel med LAM er at den kan brukes på alle celletype så lenge cellen kan gjenkjennes i tørre deler basert på posisjon og / eller strukturelle trekk. LAM har den ytterligere fordel at faste vev er brukt, som forhindrer endring av den transkripsjonelle profilen under behandlingen.
Vevet av interesse, for eksempel, floral vev, er festet i et ikke-kryssbinding fiksativ før innstøping i parafinvoks. Innstøping i parafinvoks kan gjøres manuelt, følger etablerte protokoller 9,11. Men bruk av en automatisert vev prosessor for dehydrering og infiltrering med voks generelt resulterer i høyere reproduserbarhet når det gjelder bevaring av RNA kvalitet og vev morfologi. Den alternative strategi med å bygge inn vev i harpiks har også blitt brukt med hell for celletype-spesifikk analyse av LAM 8. Imidlertid har bruken av en automrerte vev prosessor for innebygging i voks er svært tidseffektiv, som mange prøver kan behandles samtidig krever et minimum av hands-on tid. Mens vanligvis ingen signifikant tap av RNA kvalitet oppstår under fiksering og forankring, ved fremstilling av tynne seksjoner med mikrotomen og, i særdeleshet, montering på frameslides som brukes for LAM forblir et kritisk trinn for preservering av RNA kvalitet. Det har tidligere blitt nevnt og anvendelsen av et bånd overføringssystem har blitt beskrevet til å resultere i bedre RNA kvalitet på dette trinnet 12. Men dette legger et ekstra tidkrevende trinn under forberedelse av lysbildene og krever også spesialutstyr. Den optimaliserte protokollen beskrevet nedenfor reproduserbart produserer RNA som er av tilstrekkelig kvalitet for transkripsjonen profilering med GeneCHIPs og Next Generation Sequencing (NGS) nærmer 7,11,13,14. I tillegg, med laser mikrodisseksjon mikroskop, en høy renhet av de isolerte celletypene er fluktinely produsert 7,11,13,14.
Slekten Boechera er en utmerket modellsystem for å studere de viktigste trinnene av småarter reproduksjon. I Boechera, har en rekke forskjellige seksuelle og småarter akses blitt identifisert, og kan brukes for komparative analyser 15,16,17. I en sammenligning av celletype-spesifikke transcriptomes av celler fra den kvinnelige kimlinje fra seksuell Arabidopsis og småarter Boechera identifiserte vi gener og stier som er forskjellig uttrykt, og dermed identifisere nye sider ved reguleringsprosessene som styrer apomiksis 7. I tillegg har denne undersøkelsen bekreftet egnetheten LAM for celletype-spesifikk transcriptional analyser av små og sjeldne celletyper. Vi har allerede benyttet denne protokollen for analyse av forskjellige celletyper i en rekke forskjellige plantearter, men arts- og vevs-spesifikke modifikasjoner av protokollen kan være nødvendig i visse tilfeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er egnet for ulike celler og vev Typer
LAM kombinert med transkriptomet analyser av mikromatriser eller RNA-Seq er et verdifullt verktøy for å få innsikt i bestemte mønstre av genaktivitet som regulerer utvikling eller fysiologiske prosesser 7-11,13,14. Imidlertid egnetheten av denne metode for en gitt celletype er kritisk avhengig av strukturelle problemer. Cellen må være godt synlig og entydig identifiserbare i de tørre delene som brukes for L…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
Referências
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
