Une méthode pour cibler et Isoler Airway-innervant neurones sensoriels chez la souris
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
nerfs somatosensoriels transduction des stimuli nocifs causés par les deux agents endogènes et environnementaux thermiques, mécaniques, chimiques et. Les corps cellulaires de ces neurones afférents se trouvent à l'intérieur des ganglions sensoriels. ganglions sensoriels innervent un organe ou une partie spécifique du corps. Par exemple, les ganglions rachidiens (DRG) sont situés dans la colonne vertébrale et d'étendre les processus à travers le corps et les membres. Le ganglion de Gasser sont situés dans le crâne et innervent la face, et des voies respiratoires supérieures. afférences vagales des ganglions noueux prolongent tout au long de l'intestin, le cœur et les poumons. Les neurones noueux contrôlent un large éventail de fonctions telles que: la fréquence respiratoire, irritation des voies respiratoires, et les réflexes de toux. Ainsi, de comprendre et de manipuler leur fonction, il est essentiel d'identifier et d'isoler des sous-populations neuronales spécifiques des voies respiratoires. Chez la souris, les voies respiratoires sont exposés à un colorant traceur fluorescent, bleu rapide, pour le traçage rétrograde spécifique des voies aériennes noueux neurones. Les ganglions noueux sont dissociés et cellules activées par fluorescence (FAC) tri est utilisé pour recueillir des cellules positives de colorant. Ensuite, l'acide ribonucléique de haute qualité (ARN) est extrait à partir des cellules positives de colorants pour le séquençage de la prochaine génération. En utilisant cette méthode intubation expression spécifique du gène neuronal est déterminé.
Introduction
nerfs somatosensoriels transduction des stimuli nocifs causés par les deux agents endogènes et environnementaux thermiques, mécaniques, chimiques et. Les corps cellulaires de ces nerfs afférents sont situés dans les ganglions sensoriels, comme la racine dorsale, du trijumeau ou des ganglions noueux. Chaque ganglions sensitifs innerve régions spécifiques du corps et contient des cellules qui innervent les organes et tissus séparés dans cette région. Par exemple, les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont situés dans la colonne vertébrale et d' étendre les processus à travers le corps et les membres, tandis que les ganglions trigéminés sont situés dans le crâne, contenant les neurones qui innervent le visage, les yeux, des méninges ou des voies aériennes supérieures 1, 2. Les ganglions noueux du nerf pneumogastrique est situé dans le col au- dessous du crâne et qui contient des corps cellulaires qui prolongent les fibres nerveuses dans tout le tractus gastro – intestinal, le cœur et les poumons et les voies respiratoires inférieures 3. Chez l'homme, ganglion noueux est seule, cependant, chez la souris, il est fusionnéavec le ganglion jugulaires, qui innerve aussi les poumons 4. Ce ganglion fusionné est souvent appelée la jugulaire / noueux complexe, ganglion vagal, ou simplement ganglion noueux 5. Ici, elle est désignée sous le ganglion noueux.
afférences du noueux transmettent des informations à partir des viscères vers le noyau du tractus solitaire (NTS) dans le tronc cérébral. Entrée sensorielle à ce ganglion unique contrôle un large éventail de fonctions, telles que la motilité intestinale 6, la fréquence cardiaque 7, respiration 8,9, et les réponses respiratoires irritantes activées 10,11. Avec cette diversité de fonctions et organes innervés, il est essentiel de cibler et d'isoler des sous-populations spécifiques d'organes du ganglion noueux afin d'étudier les voies neuronales individuelles. Toutefois, étant donné la petite taille de l'noueux et le nombre limité de neurones qu'il contient ce n'est pas une tâche triviale. Chaque souris noueux ganglion contient environ 5000 neurones 12en plus d'une population étendue de cellules de soutien du satellite. Sur les 5.000 neurones noueux, seulement 3-5% innervent les voies respiratoires. Par conséquent, les modifications fonctionnelles, morphologiques ou moléculaires dans les neurones des voies aériennes innervant, en raison de la stimulation ou pathologies respiratoires, seront perdus dans le ganglion noueux dense.
Pour résoudre ce problème, un procédé a été développé pour identifier et isoler les neurones qui innervent les voies respiratoires. Les voies respiratoires ont été exposés à un colorant traceur fluorescent pour identifier les neurones innervant de noueux ultérieures. Fast Blue a été repris par les neurones et se déplace rapidement à leurs corps cellulaires où elle est conservée pendant jusqu'à huit semaines 13 – 15. Une fois identifié, un protocole de dissociation douce mais efficace a été utilisée pour préserver l'étiquetage de colorant et la viabilité des cellules pour les cellules activées par fluorescence (FAC) de tri. Les cellules triées sont utilisées pour extraire l'acide ribonucléique de haute qualité (ARN) afin de déterminer l'expression du gène ou de fou une autre analyse moléculaire en aval. Ce protocole fournit une technique utile et robuste pour isoler les neurones sensoriels qui innervent un tissu d'intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit un procédé pour cibler des neurones innervant des voies aériennes dans les ganglions noueux du nerf vague. Une fois marqué, les ganglions sont doucement dissociés pour préserver de manière optimale le nombre de cellules et la viabilité. Ces neurones sont ensuite triés FAC directement dans le tampon de lyse et l'ARN est extrait. L'importance de ce protocole est la capacité de cibler, d'isoler et de préserver la qualité d'une population spécifique de cellules sensorielles….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutenu par des subventions du NIH R01HL105635 à SEJ. Les auteurs tiennent à remercier Diego V. Bohórquez pour des conseils techniques. Nous remercions également R. Ian Cumming pour l'assistance technique et en effectuant la cytométrie en flux à l'installation de vaccin humain Duke Institut de recherche de cytométrie en flux de ressources partagées (Durham, Caroline du Nord). La cytométrie en flux a été réalisée dans le laboratoire de bioconfinement régional à Duke, qui a reçu un soutien partiel pour la construction des Instituts nationaux de la santé, Institut national des allergies et des maladies infectieuses (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
Referências
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