BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포 집단을 생성하기위한 프로토콜이 개발되었지만, 이들은 일반적으로 혼합 된 세포 표현형을 얻었다. 특정 심근 세포 아형을 포함하는 연구를 추구에 관심 연구진은보다 감독 차별화 접근법을 필요로한다. Grem2 생체 내 심방 실 형성에 필요한 분비 BMP 길항제와 마우스 배아 줄기 (ES) 세포를 처리하여, 심방 심장 세포 표현형 다수 생성 할 수있다. 설계 Myh6-을 DsRed-NUC 능성 줄기 세포주를 사용 식별, 선택 및 심근 정화용 수있다. 이 프로토콜에서 배아 체는 매달려 드롭 방법을 사용하여 Myh6-을 DsRed-NUC 세포에서 생성 및 분화 날 4 (D4)까지 정지 유지하고 있습니다. 셀 D4에 Grem2로 처리 젤라틴 코팅 된 플레이트 상에 도금. D8-D10 큰 계약 지역 문화에서 관찰 및 확장을 계속하고 m되는 사이D14을 통해 ature. 분자는 조직 학적 및 electrophysiogical 분석 Grem2 처리 한 세포에서 세포가 심방 심근의 생물학 및 다양한 약리 에이전트에 대한 반응을 연구하기 위해 체외 모델을 제공 심방과 같은 특성을 획득 나타냅니다.
Introduction
다 능성 줄기 세포를 생성하고, 특히 인간 1-5에서는 기초 연구 및 비 임상 연구에 대한 액세스 조직에 어려운 호스트로부터 세포를 연구하기위한 강력한 도구이다. 발달 신호 경로를 적절히 조절하여 원하는 표현형 운명 다 능성 줄기 세포의 분화를 유도 할 수있다. 대부분의 프로토콜은 다 능성 줄기 세포로부터 심근 6-14 (CMS)를 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 프로토콜은 일반적으로 TFGβ 수퍼 패밀리 (티빈, BMP, 및 TGFβ)과의 Wnt 외생 적 성장 인자 및 / 또는 작은 분자 10,12-15의 시간 제한 추가를 통해 경로의 변조를 포함한다. 이러한 프로토콜은 CMS에가 세포의 비율을 증가 시키는데 일반적으로 효과적이지만, 심방, 심실 및 노드 / 전도 시스템의 계통을 나타내는 세포의 혼합 집단을 생성 특이성이 부족하다. 특정 심장을 연구하기 위해 더 많은 지시 차별화 아프로을 아류ACH가 필요합니다.
Gremlin2 (단 짧은에 대한 켈베로스 또는 PRDC 관련 Grem2라고도 단백질) 제브라 피쉬 (16)의 심장 개발하는 동안 적절한 심장 차별화와 심방 실 형성에 필요한 분비 BMP 길항제이다. 단지 중배엽 마커 T-Brachyury 1 등 켈베로스의 피크 식 후, 분화 4 일에 Grem2와 차별화 된 배아 줄기 세포 치료,의 CM의 수율을 증가시키고 주로 심방 혈통 (14)의 세포의 풀을 생성합니다.
재조합 Grem2는 분화 세포를 치료하는 데 사용되는 표준 단백질 생산 기술 (17)을 사용하여 제조 될 수 있거나 또는 시중에서 구입할 수있다. 이 수용액에 용해되는 고도로 원하는 시점에서 배양 물에 외생 첨가 될 수있다.
차별화 마커 담당자의 발현을 정량 RT-qPCR에를 사용하여 추적 할 수 있습니다심장 혈관 전구 세포, 심장 전구 세포, 그리고 헌신의 CM의. 면역은 식별 심장 세포 유형의 공간 분포를 가시화 할 수있다.
식별 CMS에 분리 리포터 시스템을 사용하는 경우에 순수 집단을 필요로하는 응용 프로그램은 더 용이하게 수행된다. 이를 위해, 우리는 αMHC-DsRedNuc 마우스 CGR8 ES 세포주 (14)로 구성 도입했다. CGR8 세포 확장 및 분화 검정 (18)을 용이하게 성장 피더 세포 능성없이 남아있다. ES 세포주는 유전자 프로모터 (MHC 또는 Myh6 α) 심장 관련 알파 마이 오신 무거운 체인에서 핵 지역화 신호을 DsRed 형광 단백질 코딩 서열이 포함되어 있습니다. 이들 세포를 사용하여, CMS는 쉽게 식별 및 정량화 셀 정렬 전기 생리학, 약물 스크린, 심방 분화 기전을 연구 단리 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 정기적으로 심방 혈통의 특징의 CM의 높은 비율과 문화를 생산하고 있습니다. 모든 분화 프로토콜로서, 분화 이전 mESCs의 품질에 특별한주의를 기울여야한다. mESCs 정기적으로 적절한 형태 (그림 1A)에 대해 모니터링해야한다. 이전에 사채의 형성 발생 된 자연 분화는 심각 cardiogenesis의 효율성을 제한합니다 (그림 1B)를 계대 전에 제거해야합니다. EB의 크기도…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 HL083958 및 HL100398 (AKH)와 2T32HL007411-33에 의해 지원되었다 "심장 혈관 메커니즘의 프로그램 : 조사에서 훈련을"(JB)를.
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
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