Анализ клинико-патологическими микроРНК выражения при раке молочной железы ТКАНЕЙ с помощью микроРНК<em> В Ситу</em> Гибридизация
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
Рак молочной железы является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний, влияющих на женское население по всему земному шару. Более 1,3 миллиона случаев рака молочной железы сообщают каждый год по всему миру 1,2. Хотя опухолевые клетки традиционно считаются биологически гомогенным и высоко пролиферативные, стало очевидным, что рак молочной железы является генетически и клинически неоднородна. Устойчивость к распространенных противоопухолевых препаратов является отличительной чертой на поздних стадиях рака молочной железы, что приводит к смерти в большинстве пациентов через ее облегчения прогрессирования рака и метастазирования расстояния 3.
MicroRNAs (миРНК) представляют собой класс небольших молекул РНК примерно длиной 22 нуклеотидов , которые регулируют экспрессию генов путем блокирования трансляции мРНК или опосредовать деградацию мРНК 4. Более 2000 различных микроРНК до сих пор были идентифицированы у людей, которые связаны с заболеваниями человека 5. Увеличивается массив исследований ВГАе показали , что микроРНК может функционировать в качестве онкогенов и опухолевых супрессоров и часто дизрегуляции в опухолях 6. микроРНК сильно влияет на все первичные онкогенеза, контролируя основные регуляторы клеточного цикла, старении, апоптоза и аутофагии, наряду с таковыми из опухолевых клеток моторики, инвазию и метастазирование 7.
Выражение Аберрантная микроРНК было также связано с клиническими проявлениями , такими как стадия, дифференцировка, прогноза и ответа на адъювантной терапии 8. В частности, повышенная экспрессия микроРНК-146 коррелирует с плохим прогнозом при раке легкого пациентов 9. Другое исследование показало , что потеряли выражение микроРНК-let7b связана с злокачественными фенотипами и, как следствие, плохой выживаемости 6. Понимание типов клеток и структур, которые выражают микроРНК является важной частью понимания механики, через которые изменения в микроРНК выражение влияния клетки иткани фенотипы 10. Некоторые микроРНК найдены секретируется в стромальных клетках попадала в эпителиальных клетках и специфически воздействуют на их цели. В том же ключе, микроРНК-212 и микроРНК-132 секретируется стромы и регулировать эпителиальные-стромальных взаимодействий , необходимых для протоковой выроста в процессе развития молочной железы 11. Основная цель данной работы состоит в объяснении подробный протокол для выявления экспрессии микроРНК в тканях молочной железы с помощью микроРНК гибридизация. Мы оптимизировали все условия для анализа уровней экспрессии микроРНК-489 в образцах рака молочной железы пациента. С этой целью мы использовали DIG маркированы заперта кислоты (LNA) зонд нуклеиновой в нашем эксперименте. Некоторые из нуклеотидов имели модификацию МШУ, то есть, метиленовый мостик, соединяющий 2 'атом кислорода и 4' атом углерода рибозы основной цепи, которая фиксирует нуклеотид таким образом, что он остается "запертой на месте" после того, как гибридизации. В результате, это гораздо сложнеедля гибридизированных комплекс для денатурации 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель данного исследования состояла в том, чтобы определить уровень экспрессии микроРНК в тканях молочной железы с использованием микроРНК гибридизация. Следует отметить, что в этом эксперименте все условия были оптимизированы для ткани рака молочной железы. Дальнейшая оптимиза?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
Referências
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2′-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
