Vi beskriver ett effektivt, robust och kostnadseffektiv metod för att extrahera nukleinsyra från bomullstoppar för karakterisering av bakteriesamhällen med hjälp av 16S rRNA-genen amplikon sekvensering. Metoden gör det möjligt för en gemensam strategi för flera provtyper bearbetning och rymmer ett antal efterföljande analytiska processer.
Det finns ett växande intresse för rollen av mikrobiella samhällen som kritiska modulatorer av människors hälsa och sjukdom. Hög kapacitet sekvenseringsteknologier har gjort det möjligt för en snabb och effektiv karakterisering av bakteriesamhällen med hjälp av 16S rRNA gensekvenser från en rad olika källor. Även lättillgängliga verktyg för 16S rRNA-sekvensanalys har standardiserade beräkningsarbetsflöden, urval bearbetning för DNA-extraktion förblir en fortsatt källa till variationen mellan studierna. Här beskriver vi en effektiv, robust och kostnadseffektiv metod för att extrahera nukleinsyra från bomullstoppar. Vi avgränsa också metoder nedströms för 16S rRNA gensekvenser, inklusive generering av sekvense bibliotek, kvalitetskontroll, och sekvensanalys. Arbetsflödet kan rymma flera prover slag, inklusive avföring och bomullstoppar som samlats in från en mängd olika anatomiska platser och värdarter. Dessutom utvanns DNA och RNA kan separeras och användasför andra tillämpningar, inklusive hela genom sekvensering eller RNA-punkter. Den beskrivna metoden gör det möjligt för en gemensam strategi för flera provtyper bearbetning och rymmer nedströms analys av genomiskt, metagenomic och transkriptions information.
Den mänskliga lägre reproduktionsorganen, mag-tarmsystemet, andningsorgan och hud koloniseras av komplexa bakteriesamhällen som är kritiska för att upprätthålla vävnadshomeostas och stödja hälsan hos värd en. Till exempel, vissa laktobaciller skapa en ogästvänlig miljö för patogener genom surgöring av vaginalvalvet, som producerar antimikrobiella effektenheter och modulera lokala värden immunitet 2-4. Ett växande intresse för den bakteriella microbiome betydelse har också ökat intresset för att karakterisera bakteriesamhällen i många kliniska sammanhang. Här beskriver vi en metod för att bestämma sammansättningen av den bakteriella microbiome från genitala sekretprov. Protokollet kan lätt modifieras för avföringsprov och bomullstoppar som samlats in från andra anatomiska platser och andra värdarter.
På grund av de inneboende begränsningar i antalet prover som kan samlas in och lagras av en given tappy deltagare, var detta protokoll för att extrahera DNA, RNA, och potentiellt ännu protein från en enda pinnprovet med en anpassad fenol-kloroform baserad bead-stryk-metoden 5,6. Kombinationen av fysiska avbrott i bakteriecellväggar med pärla-stryk och kemiska störningar med tvättmedel möjliggör snabb lys av grampositiva, gramnegativa, och syrafasta bakterier utan ytterligare enzymatisk spjälkning steg. För att få hög kvalitet RNA, är det rekommenderat att använda torra kompresser som hölls vid eller under 4 ° C omedelbart efter provtagningen och under transporten till laboratoriet (i förekommande fall), och lagras långsiktigt vid -80 ° C.
För att bestämma den bakteriella microbiome inom ett givet prov, utnyttjar denna procedur 16S rRNA-genen amplikon sekvensering, som är för närvarande den mest kostnadseffektiva sättet att på ett heltäckande tilldela bakteriell taxonomi och utföra relativ kvantifiering. Alternativa metoder innefattar riktade qPCR 7, anpassad microarrays 8, och hel-genomet sekvense 9. 16S rRNA-genen innehåller nio hypervariabla regioner, och det finns ingen enighet om den optimala V-regionen för att sekvensera för vaginala microbiome studier. Här använder vi 515F / 806R primer set och bygga på rörledningen designad av Caporaso et al. 10-12. Caporaso et al. 'S 515F / 806R primer uppsättning möjliggör multiplexering av hundratals prover på en enda sekvenseringskörning beror på tillgången av tusentals validerade streckkodade primers och kompatibilitet med Illumina sekvense plattformar. Till skillnad från Human Microbiome Projects 27F / 338R primer set 13, 515F / 806R också effektivt förstärker Bifidobacteriaceae och därmed exakt fångar Gardnerella vaginalis, en viktig medlem av den vaginala mikrobiella i vissa kvinnor. Alternativt har en 338F / 806R primerpar framgångsrikt använts för Pyrosequencing av vaginala prover 14 och en 515F / 926R primerparet har recently blir tillgängliga för nästa generations sekvensering 12.
Slutligen ger detta protokoll grundläggande instruktioner för att utföra 16S amplikon analys med hjälp av kvantitativa Insikter i Microbial Ecology (QIIME) programpaketet 15. Ett framgångsrikt genomförande av QIIME kommandon som beskrivs här ger en tabell som innehåller bakterie taxonomiska förekomster för varje prov. Många ytterligare kvalitetskontrollsteg, taxonomiska klassificeringsmetoder och analyssteg kan införlivas i analysen som beskrivs i detalj på QIIME webbplats (http://qiime.org/index.html). Om analysen kommer att utföras på en Apple-dator, den MacQIIME paketet 16 ger enkel installation av QIIME och dess beroenden. Alternativa mjukvarupaket för 16S rRNA-genen sekvensanalys inkluderar Mothur 17 och UPARSE 18.
Här beskriver vi ett protokoll för identifiering och karakterisering av relativa bakterie förekomster inom en mänsklig vaginala pinn. Detta protokoll kan enkelt anpassas för andra provtyper, såsom avföring och svabbar av andra kroppsställen, och prover som tagits från en mängd olika källor. Extraktionen av nukleinsyra genom bead-stryk i en buffrad lösning av fenol och kloroform tillåter isolering av både DNA och RNA, vilket är särskilt viktigt när man arbetar med dyrbara prover som samlats genom kliniska studier. Det isolerade bakterie-DNA är utmärkt för bakteriell taxonomisk identifiering och genom montering, medan samtidig insamling av RNA ger möjlighet att bestämma funktionell bakteriell, värd och virala bidrag genom RNA-punkter. Den beskrivna protokollet använder en validerad ett steg primer uppsättning som har framgångsrikt använts på ett brett spektrum av provtyper, inklusive människa, hund, och miljöprover 10 </sup>. Tillgången till tusentals streckkodade primers möjliggör multiplexering av prover och enorma besparingar på sekvense kostnader. Den totala kostnaden (inklusive alla reagenser, en enda sekvenseringskörning, och primers men inte utrustning) är ca $ 20 per prov när 200 prover multiplexeras. Dessutom finns det mycket hög reproducerbarhet när flera svabbar från samma prov plats behandlas oberoende genom hela rörledningen. Sammantaget är det protokoll som kostnadseffektivt, flexibelt, pålitligt och repeterbara.
Nukleinsyra utvinning del av detta protokoll begränsas av de säkerhetsåtgärder som krävs när man arbetar med fenol och kloroform, och de utmaningar som att automatisera rörledning till en hög genomströmning, 96-brunnar format. Dessutom kraftig pärla slå används för mekaniska lys sax i bakterie-DNA till cirka 6 kilo fragment; om längre DNA-fragment krävs för tillämpningar efter, hur länge pärla slå should förkortas. Begränsningarna i bakterieidentifieringsdelen av detta protokoll är inneboende någon metod som bygger på 16S rRNA-genen sekvensering. 16S rRNA-sekvensering är idealisk för bakterie identifiering släktet och även artnivå, men sällan ger identifikationsstamnivå. Medan V4 variabla regionen av 16S rRNA-genen ger en robust diskriminering bland de flesta bakteriearter 11, kan ytterligare beräkningsmetoder som Oligotyping 31 måste användas för att exakt identifiera vissa arter, såsom Lactobacillus crispatus. Slutligen kan information om de exakta bakteriella funktionella kompetens inom ett visst prov inte bestämmas av 16S rRNA gensekvenser ensam, men detta protokoll möjliggör extraktion av hela genomet DNA och RNA som kan användas mot detta ändamål.
Den mest kritiska steget för att säkerställa framgång med detta protokoll tar stor omsorg för att förhindra kontaminering during provtagning, nukleinsyra extraktion och PCR-förstärkning. Säkerställa sterilitet vid tidpunkten för provtagning genom att bära rena handskar och med sterila kompresser, rör och saxar. För att bedöma för förorening av uppsamlingsmaterial, samla negativa kontrollpinnar genom att placera ytterligare oanvända kompresser direkt i transportrören vid tidpunkten för provtagningen. I labbet, utföra alla pre-förstärkningssteg i en steriliserad huva som endast innehåller sanerade leveranser och använder endast molekylärbiologisk kvalitet, DNA-fria reagens. Under nukleinsyra utvinning, förhindra korskontaminering med hjälp av nya steril pincett och fräscha handskar med varje prov, och hålla alla rör stängda inte i bruk. Bearbetning oanvända kompresser parallellt säkerställer sterilitet både provtagning och nukleinsyra extraktion; de oanvända kompresser bör inte ge en pellet efter isopropanolutfällning och etanol tvätt. Om en pellet visas gör 16S rRNA genamplifiering att bestämma en möjlig källa tillföroreningen (t.ex. skulle närvaron av Streptococcus eller Staphylococcus indikera hudkontamination). Dessutom utför PCR-amplifieringar utan templat kontrollreaktioner parallellt för att säkerställa att PCR-reagens och reaktioner inte har förorenats. Om ett band visas i en kontroll utan templat, kassera reagensen och upprepa förstärkning med färska reagens. Tar dessa försiktighetsåtgärder kommer att säkerställa framgångsrik sekvensering av bakterier av intresse.
PCR-amplifieringssteg tenderar att kräva mest felsökning. Förstärkning i uppsättningar av tolv prover ger en balans mellan effektivitet och konsekvens. Den fullständiga frånvaron av band i alla prover i en given förstärkning uppsättning indikerar en systematisk underlåtenhet, t.ex. glömmer att lägga till ett reagens eller felaktigt programmering av termo. Frånvaron av ett band från några prover är oftast på grund av den mänskliga faktorn, och förstärkningar bör åter run med samma hopkoppling av prov och omvänd primer. I fallet med långvarig frånvaro av ett band, kan provet åter amplifieras med användning av en omvänd primer med en annan streckkod. Upprepade förstärknings misslyckanden med flera omvända primers kan tyda på en inhibitor närvarande i provet. I så fall kommer rengöring av DNA med en kolonn ofta avlägsna inhibitorer utan någon väsentlig ändring relativa bakteriella abundances. Om flera band resultera efter amplifiering, re-amplifiera provet med en annan omvänd primer streckkod.
Förutom att förebygga miljöförorening och säkerställa förstärkning av en enda specifik produkt, förlitar sig framgångsrik sekvensevård vid beredning av biblioteket poolen. Målet är att kombinera ekvimolära mängder av varje prov: s amplikoner för att säkerställa ungefär samma antal sekvensavläsningar per prov. Om nukleinsyran koncentrationer före amplifiering är jämförbara, att helt enkelt lägga lika stora volymer av varje sample s amplikoner är tillräcklig när du skapar bibliotekspoolen. Om emellertid de nukleinsyra-koncentrationerna är väldigt olika och sattes i lika stor volym, provet med den låga nukleinsyrakoncentrationen kommer att dåligt representerade med ett lågt antal läsningar. I detta fall är det möjligt att lägga till en högre volym av amplikoner från provet låg koncentration baserad på den relativa intensiteten av gelén bandet. Alternativt är det möjligt att mer noggrant avlägsna primers från de enskilda amplikoner, kvantifiera enskilda provets amplikon koncentration med hjälp av en fluorometrisk dsDNA kvantifiering kit, och exakt kombinera ekvimolära mängder av varje prov.
När en välbalanserad amplicon pool genereras, blir det viktigt att noggrant mäta poolen koncentration. Efterföljande försiktig utspädning och spike-in med PhiX att öka läs- komplexitet är avgörande för att uppnå optimal sekvense resultat. Hög genomströmning sequencers som använder sequencing genom syntes är mycket känsliga för klustret tätheten på flödescellen. Laddar ett bibliotek pool som är alltför koncentrerad kommer att resultera i overclustering, med lägre kvalitetsresultat, lägre datautgång och felaktig demultiplexering 32. Laddning av en bibliotekspool som är för utspädd kommer också att resultera i låg datautgång. Noggrant kvantifiera biblioteket poolen före sekvensering kommer att säkerställa optimala resultat.
16S rRNA gensekvenser ger en övergripande bedömning av de bakterier som finns i ett givet prov och är en absolut avgörande första steg i hypotes generation. Närvaron av en rik uppsättning av metadata ytterligare gör det möjligt för forskare att testa associationer mellan speciella bakteriearter och viktiga biologiska faktorer. Dessutom kan samma 16S informationen användas för att sluta sig till bakteriella funktioner med hjälp med verktyg som PICRUSt 33. Det slutliga målet är att använda 16S karakterisering att identifiera nya föreningar som kan varavidare testats och godkänts i modellsystem, lägga till vår växande förståelse av effekterna av den bakteriella microbiome på människors hälsa och sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Elizabeth Byrne, David Gootenberg och Christina Gosmann för kritisk feedback på protokollet; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco, och Jason Norman för provberedning vägledning och demonstrationer; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower, Skip Virgin, och Bruce Walker för protokoll råd och givande diskussioner; och Jessica Hoisington-Lopez för sekvense stöd. Detta arbete stöddes av Bill och Melinda Gates Foundation och NIAID (1R01AI111918). DSK fick ytterligare stöd från Burroughs Wellcome Fund. MNA stöddes av tilldelning nummer T32GM007753 från NIGMS, och Paul och Daisy Soros gemenskap. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIGMS eller NIH.
Equipment: | |||
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers: | |||
515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |