Prosedyre for å vurdere effektiviteten av Fnokker for fjerning av dispergert Partikler fra planteekstrakter

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

Planter er mye brukt til å produsere mat varer som fruktjuicer, men de kan også utvikles som plattformer for produksjon av høyere verdi biofarmasøytisk produkter ^1-3. I begge tilfeller nedstrømsprosessering (DSP) begynner ofte med utvinning av væsker fra vev som blader eller frukter, etterfulgt av rensing av partikkelladede ekstrakter ^4,5. For fremstilling av Biopharmaceuticals, kan kostnadene ved DSP utgjøre opptil 80% av de totale produksjonskostnadene ^6,7, og dette delvis skyldes den høye partikkelbelastningen til stede i ekstrakter fremstilt av forstyrrende metoder så som blad-baserte homogenisering ^8,9 . Selv om rasjonelt valg av filterlag som passer til partikkelstørrelsesfordelingen i ekstraktet kan øke filterkapasiteten og redusere kostnadene ^10,11, kan forbedringen aldri overstige taket av absolutt kapasitet definert av antall partikler som må bibeholdes perenhet av filterområdet for å oppnå avklaring.

Taket kan løftes hvis færre partikler nå overflaten av de fineste filtrene i filtrerings toget, og dette kan oppnås hvis dispergerte partikler blandes med polymerer som er kjent som flokkuleringsmidler som fremmer aggregering for å danne store fnokker ^12. Slike fnokker kan beholdes lenger oppstrøms av grovere og mindre kostbare posefiltre, redusere partikkelbelastningen nå finere og mer kostbare dybdefiltre. Polymerene skal ha sikkerhetsprofil som passer for sine applikasjoner, for eksempel for Biopharmaceuticals de må være i samsvar med god framstillingspraksis (GMP), og vanligvis de må ha en molekylvekt> 100 kDa og kan enten være nøytral eller belastes ^13. Mens nøytrale flocculants generelt opptre ved kryssbinding spredt partikler forårsaker deres aggregering og dannelsen av flokker med diameter> 1 mm ^11, ladede polymerer nøytralisere ansvaret for dispersed partikler, noe som reduserer deres løselighet og dermed forårsaker utfelling ^14.

Flokkulering kan forbedres ved å justere parametere som buffer pH eller ledningsevne, og polymeren type eller konsentrasjon, for å samsvare med egenskapene til ekstraktet ^15,16. For tobakkekstrakter forbehandlet med 0,5-5,0 g L ^-1 polyetylenimin (PEI), større enn 2 ganger økning i dybdefilter kapasitet ble rapportert i en 100 L pilot-skala prosess. Kostnaden for denne polymer er mindre enn € 10 kg ^-1 så sin innføring i prosessen resulterte i kostnadsbesparelser på rundt € 6000 for filtre og forbruksvarer per batch ¹⁶ eller enda mer når den kombineres med cellulosebasert filter hjelpemidler ^17. Likevel er prediktive modeller nødvendig for å evaluere en priori økonomiske fordelene av flokkuleringsmidler fordi deres inkludering kan kreve hold trinn på 15-30 min ^16,18, noe som resulterer i ytterligere investeringskostnader for lagringtanker. Men det er ikke mekanistiske modeller som kan forutsi utfallet av slike eksperimenter på grunn av den komplekse natur flokkulering. Derfor ble en mer hensiktsmessig utforming-av-eksperimenter (DoE) tilnærming ¹⁹ utviklet som beskrevet i denne artikkelen. En protokoll for den generelle DoE prosedyren har nylig blitt publisert ^20.

Småskala enheter er nå tilgjengelig for high-throughput screening av flokkulering forhold ^21. Imidlertid kan disse anordninger ikke realistisk å simulere forholdene under flokkulering av plante-ekstrakter fordi dimensjonene på reaksjonsbeholderen (~ 7 mm til brønnene på en 96-brønns plate), og partiklene eller fnokkene kan være mindre enn en størrelsesorden fra hverandre. Dette kan påvirke blande mønstre og dermed prediktiv kraft av modellen. Videre kan det være vanskelig å skalere ned prosesser som involverer utfelling som skyldes ikke-lineære endringer i blande oppførsel og bunnfallet staheten ^22. Derfor skisserer denne artikkelen en benk-top-skala screening system med en gjennomstrømning på 50-75 prøver per dag, noe som gir resultater som er skalerbar fra den innledende 20 ml reaksjonsvolum til en 100 L pilot-skala prosess ^16. Når det kombineres med en DoE tilnærming, gjør dette at prediktive modeller som skal brukes til prosessoptimalisering og dokumentasjon som en del av en kvalitet-for-designkonsept.

Metoden er beskrevet nedenfor, kan også tilpasses Biopharmaceuticals produsert i cellekultur-baserte prosesser, hvor flokkuleringsmidler også vurderes som et kostnadsbesparende verktøy ^23. Den kan også brukes til å modellere utfelling av target-proteiner fra et urent ekstrakt som en del av en rensestrategi, som vist for β-glukuronidase produsert i raps, mais og soyabønner ^24,25. En detaljert beskrivelse av flokkuleringsmiddel egenskaper kan finnes andre steder ^16,26, og det er viktig å sikre at polymeren konsentrasjonersjoner er enten ikke-toksiske eller skadelige nivåer under i det endelige produkt ^11.

Protocol

1. Utvikle en Tilstrekkelig Experimental Strategy Identifiser de miljømessige og prosessparametre som er relevante for flokkulering prosedyre skal etableres eller optimalisert, det vil si hvilke faktorer har sterkest effekt på flokkulering. Vanligvis er det flere slike parametere så en DOE metode som nylig beskrevet 20 er nødvendig på grunn av mangel på mekanistiske modeller. Velg parametere (faktorer) basert på litteraturdata 12, tidligere kunnskap og erfaring m…

Representative Results

Flokkulering av tobakk ekstrakt med forskjellige polymerer Fremgangsmåten beskrevet ovenfor ble med hell anvendt for å utvikle en fremgangsmåte for flokkulering av tobakkekstrakter under fremstillingen av et monoklonalt antistoff (HIV-nøytraliserende antistoff 2G12) og et fluorescerende protein (DsRed) (figur 1) 16, og har siden blitt overført til andre proteiner, inkludert lektiner, malaria va…

Discussion

Det viktigste å vurdere når du setter opp en DoE å karakterisere partikkel flokkulering er at design skal i prinsippet kunne oppdage og beskrive forventede eller mulige effekter ^36,38, f.eks påvirkning av pH, polymertype og polymerkonsentrasjon ^16. Derfor er det viktig å evaluere brøkdel av design plass (FDS) før de egentlige eksperimenter. FDS er den brøkdel av det flerdimensjonale eksperimentelle plass (dekket av konstruksjonsfaktorer, for eksempel pH) innenfor hvilken d…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement