नियंत्रण रेखा एमएस मानव प्लेटलेट्स की विश्लेषण Mitochondrial चयापचय के अध्ययन के लिए एक मंच के रूप
Summary
यहाँ हम पृथक मानव प्लेटलेट्स जटिल मैं rotenone अवरोध करनेवाला के जवाब में चयापचय रूपांतरों का अध्ययन करने के लिए मॉडल एक सुलभ पूर्व vivo के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता दिखा। यह दृष्टिकोण तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा समस्थानिक ट्रेसिंग और रिश्तेदार मात्रा का ठहराव को रोजगार और अध्ययन डिजाइन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।
Abstract
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
Introduction
बेकार mitochondrial चयापचय neurodegeneration, कैंसर और हृदय रोग के 30 सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसाया गया है। जैसे, महान प्रयास चयापचय दोष है कि रोग रोगजनन के लिए योगदान निस्र्पक पर रखा गया है। तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस) जटिल जैविक matrices से analytes की मात्रा का ठहराव के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है और अक्सर चयापचय अध्ययन 8 के लिए कार्यरत है। लेकिन, जैसा कि अक्सर जैव चिकित्सा के अध्ययन के साथ मामला है, मानव रोग के लिए प्रासंगिक एक सुलभ और अच्छी तरह से परिभाषित मॉडल को प्राप्त करने के लिए एक चुनौती है।
कई अध्ययनों से सेलुलर चयापचय 7.9 पर xenobiotics या आनुवंशिक असामान्यताएं के प्रभाव की जांच कर लिए सेलुलर मॉडल बदल रोजगार। चयापचय reprogramming कि कैंसर की कोशिकाओं में होता है confounding लागू कर सकते हैं 21 कारकों और इसलिए आदर्श नहीं हैं। इन मुद्दों circumve हो सकता हैप्राथमिक सेल मॉडल के साथ nted, हालांकि चयापचय विश्लेषण के लिए पर्याप्त बायोमास प्राप्त करने के चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, संस्कृति में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं की उच्च मात्रा के प्रभाव संभावित confounding mitochondrial अध्ययनों से 16 के रूप में प्रकाश डाला गया है।
मानव प्लेटलेट्स चयापचय अध्ययन 5,22,27,32 के लिए पर्याप्त mitochondrial सामग्री के साथ एक प्राथमिक सेल मॉडल का उपयोग करने का अवसर दे। सबसे पहले, प्लेटलेट्स को आसानी से हासिल किया जा सकता माध्यम से रक्त दाताओं से व्यक्ति, या रक्त बैंकों से बड़ी मात्रा में आ रही है, और इसलिए एक मॉडल में जो बाह्य कारकों को आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है प्रदान करते हैं। दूसरे, उनके छोटे आकार के कारण, प्लेटलेट्स आसानी से अन्य रक्त घटकों से कम से कम प्रारंभिक कार्य के साथ भी न्यूनतम सुसज्जित प्रयोगशालाओं 5 में अलग किया जा सकता है। ध्यान से, प्लेटलेट्स नाभिक शामिल नहीं है और इसलिए ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की स्वतंत्र रूप से चयापचय के लिए परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम उस दिखानेएसाइल coenzyme एक (सीओए) thioesters के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के अलावा, अलग-थलग प्लेटलेट प्रणाली कार्बन चयापचय की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विशेष रूप से, हम महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट acetyl- में [13 सी] -label के समावेश की जांच के लिए स्थिर आइसोटोप (गैर रेडियोधर्मी) लेबल [13 सी 6] -glucose और [13 सी 16] के साथ -palmitate चयापचय लेबलिंग के उपयोग की रिपोर्ट ग्लाइकोलाइसिस या फैटी एसिड ऑक्सीकरण के माध्यम से सीओए। यह जैव रासायनिक रास्ते 13,24 में एसाइल सीओए प्रजातियों की व्यापक भागीदारी और इस तरह के rotenone 3,33 के साथ जटिल मैं के निषेध के रूप में अन्य चर, का परीक्षण करने के लिए इस प्रणाली का शिक्षणीयता के कारण एक शक्तिशाली, generalizable, और बहुमुखी मंच प्रदान करता है। नीचे प्रोटोकॉल में उपलब्ध कराई गई जानकारी के अलावा, आइसोटोप लेबलिंग के लिए और नियंत्रण रेखा-MS-आधारित विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की एक व्यापक विवरण बसु और ब्लेयर 4 में पाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम परेशान mitochondrial चयापचय के अध्ययन के लिए एक मंच के रूप में अलग-थलग प्लेटलेट्स की उपयोगिता से पता चला है। विशेष रूप से, हम rotenone द्वारा जटिल मैं निषेध के जवाब में चयापचय अनुकूलन की विशेषता है।
…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एनआईएच अनुदान P30ES013508 और T32ES019851 का समर्थन स्वीकार करते हैं।
Materials
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
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