Immobilisation de Multi-biocatalyseurs dans des billes d'alginate pour cofacteur Régénération et amélioration de réutilisabilité

Summary

Présenté est le protocole de biocatalyseurs de cellules entières co-immobilisant pour la régénération du cofacteur et l'amélioration de la réutilisabilité, en utilisant la production de L-xylulose à titre d'exemple. La régénération du cofacteur est réalisée par couplage de deux souches d' Escherichia coli exprimant des enzymes fonctionnellement complémentaires; l'immobilisation du biocatalyseur à cellules entières est obtenue par l'encapsulation des cellules dans des billes d'alginate de calcium.

Abstract

Nous avons récemment développé un système de biocatalyseur à cellules entières simple, réutilisable et couplé à la capacité de régénération de cofacteur, et l'immobilisation de biocatalyseur pour un meilleur rendement de la production et la synthèse soutenue. Ci-joint décrit le processus expérimental pour l'élaboration d'un tel système composé de deux E. souches de E. coli qui expriment des enzymes fonctionnellement complémentaires. Ensemble, ces deux enzymes peuvent fonctionner de concert pour servir de médiateur à la régénération de cofacteurs chers pour améliorer le rendement de la production de la bioréaction. En outre, le procédé de synthèse d'une forme immobilisée du système couplé biocatalytique par encapsulation de cellules entières dans des billes d'alginate de calcium est signalée. A titre d'exemple, nous présentons l'amélioration de la biosynthèse de la L-xylulose à partir du L-arabinitol par couplage E. les cellules coli exprimant les enzymes L-arabinitol déhydrogénase ou la NADH oxydase. Dans des conditions optimales, et en utilisant une concentration initiale de 150mM de L-arabinitol, le rendement en L-xylulose maximale atteint 96%, ce qui est supérieur à ceux rapportés dans la littérature. La forme immobilisée des biocatalyseurs cellules entières couplées a démontré une bonne stabilité opérationnelle, le maintien de 65% du rendement obtenu dans le premier cycle après 7 cycles de réutilisation successive, tandis que le système de cellule libre presque complètement perdu l'activité catalytique. Par conséquent, les procédés présentés ici fournissent deux stratégies qui pourraient contribuer à l'amélioration de la production industrielle de L-xylulose, ainsi que d'autres composés à forte valeur ajoutée nécessitant l'utilisation de cofacteurs en général.

Introduction

Biotransformation des cellules entières en utilisant des microorganismes réductive est devenue une méthode très répandue pour la synthèse chimio-enzymatique de biomolécules dans le commerce et thérapeutiquement importantes ^{1 – 3.} Il présente plusieurs avantages sur l'utilisation d'enzymes isolées, en particulier l'élimination des procédés de purification en aval coûteuses et la démonstration d'une durée de vie prolongée ^4-7. Pour les voies biocatalytiques où les cofacteurs sont nécessaires pour la formation du produit, des systèmes de cellules entières ont le potentiel d'offrir in situ dans la régénération du cofacteur par l'addition de donneurs d' électrons co-substrats peu coûteux ^5,8,9. Cependant, cette capacité est diminuée pour les réactions qui nécessitent une concentration stoechiométrique de co-substrats rares ou coûteux ^{10 – 13.} Avec une mauvaise réutilisabilité des cellules entières, ce empêche la création d'un produ évolutif et continuSystème ction. modifications stratégiques des systèmes de cellules entières pour ces biotransformations cofacteur dépendant sont nécessaires pour surmonter les limitations mentionnées ci-dessus. Plus précisément, la combinaison de biocatalyseur de cellules entières qui agissent ensemble a été démontré que d'améliorer considérablement la productivité et la stabilité des enzymes ¹⁴ abrités. Ces facteurs, qui sont souvent essentielles pour permettre une production à grande échelle de produits commercialement viables, peuvent être optimisés en outre par biocatalytiques microbes co-immobilisant ^15. Nous avons récemment développé un système biocatalytique cellule entière simple et réutilisable qui permet à la fois la régénération du cofacteur et biocatalyseur immobilisation pour la L-xylulose production ^16. Dans cette étude, ce système a été utilisé comme un exemple pour illustrer les procédures expérimentales de l'application de ces deux stratégies pour améliorer le rendement de la production de biotransformation et biocatalyseur réutilisabilité.

L-xylulose appartient à une class de molécules biologiquement utiles nommé sucres rares. Sucres rares sont monosaccharides uniques ou des dérivés de sucre qui se produisent très rarement dans la nature, mais jouent un rôle crucial en tant qu'éléments de reconnaissance dans les molécules bioactives ^17,18. Ils ont une variété d'applications allant des édulcorants, des aliments fonctionnels ¹⁹ agents thérapeutiques potentiels. L-xylulose peut être utilisé comme un inhibiteur potentiel de plusieurs alpha-glucosidases, et peut également être utilisé comme un indicateur de l' hépatite ou la cirrhose du foie ^17,20. L'efficacité de conversion élevé de xylitol à L-xylulose dans les systèmes de cellules entières a été rapporté précédemment dans Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. 701B ^23, Bacillus pallidus Y25 ^24,25 et Escherichia coli ^26. Dans E. coli, cependant, il a été réalisé en utilisant uniquement (<67 mM) , de faibles concentrations de xylitol ²⁶ en raison des effets inhibiteurs potentiels d'une concentration initiale de xylitol supérieur à 100 mM sur l' activité de xylitol-4-déshydrogénase ^21,26. L'équilibre thermodynamique entre le xylulose et le xylitol a été montré pour favoriser fortement la formation de xylitol ^25,27. En outre, le rendement xylulose est limitée par la quantité de cofacteurs coûteux qui doivent être fournis en l'absence d'un système de situ de régénération de cofacteur. Ensemble, ces facteurs limitent le potentiel de mise à l'échelle dans les systèmes durables pour L-xylulose biosynthèse.

Pour surmonter ces limitations et améliorer le rendement de biotransformation L-xylulose, la stratégie de régénération du cofacteur a été employée d'abord par l'établissement d'un système de biocatalytique cellule entière couplée. Plus précisément, la L-arabinitol 4-déshydrogénase (EC 1.1.1.12) à partir Hypocrea jecorina (HjLAD), une enzyme dans la voie catabolique L-arabinose de champignons, a été sélectionné pour catalyser la conversion de la L-arabinitol en L-xylulose ^28,29 . Comme beaucoup d'enzymes de biosynthèse, un limitatio majeurn de HjLAD est qu'il nécessite une quantité stoechiométrique de la chère nicotinamide adénine dinucléotide cofacteur (NAD ^+, la forme oxydée du NADH) pour effectuer cette conversion. NADH oxydase trouvée dans Streptococcus pyogenes (SpNox) a été montré pour afficher une forte activité cofacteur régénération ^30,31. Profitant de cet attribut de SpNox, E. coli exprimant des cellules HjLAD pour la production de L-xylulose ont été couplés avec E. coli exprimant des cellules SpNox pour la régénération du NAD ⁺ pour stimuler la production de L-xylulose représenté par la réaction de couplage représentée sur la figure 1A. Dans des conditions optimales et en utilisant une concentration initiale de 150 mM de L-arabinitol, le rendement en L-xylulose maximale atteint 96%, ce qui rend ce système beaucoup plus efficace que ceux rapportés dans la littérature.

La stratégie d'immobilisation de cellules entières a été employée à côté d'améliorer encore la possibilité de réutilisation de la biocatalyt coupléesystème ic. Méthodes couramment utilisées pour l' immobilisation de cellules entières comprennent adsorption / liaison covalente à des matrices solides, réticulation / piégeage et l' encapsulation dans des réseaux polymères ^32. Parmi ces méthodes, la méthode la plus appropriée pour l'immobilisation des cellules est l'encapsulation dans des perles d'alginate de calcium. Leurs propriétés de gélification doux, matrice aqueuse inerte et porosité élevée aident à préserver les propriétés physiologiques et la fonctionnalité des produits biologiques encapsulées ^33. Par conséquent, le système couplé biocatalyseur contenant à la fois E. cellules de E. coli hébergeant HjLAD ou SpNox ont été immobilisés dans des billes d'alginate de calcium , pour permettre de multiples cycles de production de L-xylulose (figure 2) .Le système biocatalyseur immobilisé a démontré une bonne stabilité de fonctionnement, le maintien de 65% du rendement de conversion du premier cycle après 7 cycles de réutilisation successive, tandis que le système acellulaire presque complètement perdu son activité catalytique.

Protocol

1. Le total des cellules biocatalyseurs Préparation NOTE: Le recombinant E. cellules coli hébergeant pET28a- SpNox 31 ou pET28a- HjLAD 28 sont ci – après dénommées E. et E. coli SpNox coli HjLAD, respectivement. Inoculer une seule colonie de E. coli HjLAD dans 3 ml de milieu Luria-Bertani (LB) additionné de kanamycine (50 pg / ml) et on incube dans un i…

Representative Results

Pour permettre la régénération du cofacteur, la synthèse de la L-xylulose a été réalisée dans un système de biocatalyseur à cellules entières contenant couplée E. et E. coli HjLAD coli , des cellules SpNox. À la suite de l'optimisation des différents paramètres, la réutilisabilité de ce système a été amélioré par l' immobilisant dans des billes d'alginate de calcium (Figu…

Discussion

les progrès technologiques récents ont permis une forte augmentation dans la commercialisation de produits biothérapeutiques recombinants, ce qui entraîne une augmentation progressive de leur valeur de marché dans l'industrie de la biotechnologie. Un tel progrès est l'avènement de l' ingénierie métabolique dans des microorganismes recombinants, qui a montré une grande promesse dans l' établissement de systèmes industriels évolutifs ^38. Comme avec la plupart des procédés, la comm…

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus