補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化
Summary
提示例としてL-キシルロースの生産を使用して、補因子再生と改善された再利用のための共固定化全細胞生体触媒のためのプロトコルです。補因子再生の機能的相補酵素を表す2 大腸菌株を結合することによって達成されます。全細胞生体触媒の固定化は、カルシウムアルギネートビーズ中の細胞のカプセル化により達成されます。
Abstract
我々は最近改善された生産収量と持続的な合成のための補因子再生と生体触媒の固定化の機能を備えた、シンプルな再利用可能と連結された全細胞生体触媒システムを開発しました。本明細書に記載さ2 E.から成るこのようなシステムの開発のための実験手順であります機能的に相補的な酵素を発現する大腸菌株 。一緒に、これらの二つの酵素はバイオ反応の生成物の収率を改善するため、高価な補因子の再生を仲介する協同機能することができます。また、アルギン酸カルシウムビーズ中の全細胞のカプセル化によって結合された生体触媒システムの固定化形態を合成する方法が報告されています。一例として、我々は、Eが結合することによって、L-アラビニトールからLキシルロースの改良された生合成を提示します大腸菌細胞が酵素のL-アラビニトール脱水素酵素やNADHオキシダーゼを発現しています。最適条件下で、150の初期濃度を用いmMのL-アラビニトール、最大Lキシルロース収率は、文献に報告されたものよりも高い96％に達しました。結合した全細胞生体触媒の固定化された形態は、遊離細胞系がほぼ完全に触媒活性を失っている間、連続した再使用の7サイクル後の最初のサイクルで得られた収率の65％を維持し、良好な動作安定性を示しました。したがって、ここで報告された方法は、L-キシルロースの工業生産だけでなく、一般的には補因子の使用を必要とする他の付加価値化合物の改善に役立つ可能性が2つの戦略を提供します。
Introduction
3 –微生物を使用する還元全細胞生体内変化は、商業的および治療 的に重要な生体分子1の化学酵素合成のための普及した方法となっています。 7 –それは孤立した酵素の使用に比べていくつかの利点、特にコストのかかる下流の精製工程の排除と長寿命4のデモを提示します。補因子は、生成物の形成に必要とされる生体触媒の経路のために、全細胞系は、安価な電子供与共基質5,8,9の添加によってその場での補因子再生に提供する可能性を有します。 13 –しかし、この容量が希少または高価な補基質10の化学量論的濃度を必要とする反応のために減少します。一緒に細胞全体の貧しい再利用して、これはスケーラブルで連続のproduの確立を妨げますctionシステム。これらの補因子依存性生物変換のための全細胞システムの戦略的な改変は、前述の制限を克服するために必要とされます。具体的には、協働して動作する全細胞生体触媒の組み合わせは、有意に保有酵素14の生産性及び安定性を高めることが示されています。多くの場合、商業的に実行可能な製品の大量生産を可能にするために重要であり、これらの因子は、共固定化生体触媒微生物15によってさらに最適化することができます。我々は最近、L-キシルロース生産の16のための補因子再生と生体触媒の固定化の両方を可能にする、シンプルで再利用可能な全細胞生体触媒システムを開発しました。この研究では、このシステムは、改善された生体内変換歩留まりと生体触媒の再利用のために、これら2つの戦略を適用する実験手順を説明するための例として使用しました。
L-キシルロースは、CLAに属し生物学的に有用な分子のssは希少糖と命名します。希少糖は、自然の中で非常にまれにしか発生しないユニークな単糖類または糖誘導体であるが、生物活性分子17,18における認識要素として重要な役割を果たしています。彼らは、甘味料、機能性食品からの潜在的な治療薬19に至るまでのさまざまなアプリケーションを持っています。 Lキシルロースは、複数のαグルコシダーゼの潜在的な阻害剤として使用することができ、また、肝炎または肝硬変17,20の指標として用いることができます。全細胞系におけるLキシルロースをキシリトールの高効率変換をパントエアで以前に報告されているが21,22、 アルカリゲネス属 アナナティス 。 701B 23、 バチルス・淡蒼球 Y25 24,25および大腸菌（Escherichia coli）26。 E.で大腸菌は、しかしながら、それは唯一の原因で1よりも初期のキシリトール濃度の潜在的阻害効果に低い（<67 mM）のキシリトール濃度26を使用して達成されましたキシリトール-4-デヒドロゲナーゼ活性21,26上の00 mMの。キシルロースおよびキシリトールの間の熱力学的平衡を強くキシリトール25,27の形成に有利に働くことが示されています。さらに、キシルロース収率は、 その場 で補因子再生系の非存在下で供給されなければならない高価な補因子の量によって制限されます。一緒に、これらの要因は、L-キシルロース生合成のための持続可能なシステムにスケーリングするための可能性を制限します。
これらの制限を克服し、L-キシルロース生体内変換の収率を改善するために、補因子再生の戦略は、結合された全細胞生体触媒システムを確立することにより最初に使用しました。具体的には、 ハイポクレアジェコリーナ （HjLAD）、菌類のL-アラビノース異化経路中の酵素からのL-アラビニトール4-脱水素酵素（EC 1.1.1.12）は、L-キシルロース28,29にL-アラビニトールの変換を触媒するために選ばれました。多くの生合成酵素と同様に、主要なlimitatioHjLADのNは、この変換を実行するために高価なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補助因子（NAD +、NADHの酸化型）の化学量論量を必要とすることです。 化膿連鎖球菌 （SpNox）で見つかったNADHオキシダーゼは、高い補因子再生活性30,31を表示することが示されています。 SpNox、Eのこの属性を利用してLキシルロースの産生のためHjLADを発現する大腸菌細胞は、Eに結合されました図1（a）に示す結合された反応によって示されるL-キシルロース生産を後押しするNAD +の再生のためにSpNoxを発現している大腸菌細胞。最適な条件と150 mMのL-アラビニトールの初期濃度を使用して下に、最大Lキシルロース収率は、このシステムは、はるかに効率的な文献に報告されたものよりも製造、96％に達しました。
全細胞固定化の戦略がさらに結合されたbiocatalytの再利用性を高めるために、次の使用しましたICシステム。全細胞固定化のために一般に使用される方法は、高分子ネットワーク32内の架橋/捕捉およびカプセル化を固体マトリックスにリンク吸着/共有結合が含まれます。これらのアプローチの中で、細胞の固定化のための最も適切な方法は、カルシウムアルギネートビーズ中のカプセル化です。その穏やかなゲル化特性、不活性水性マトリックスおよび高気孔率は、カプセル化された生物学的製剤33の生理学的特性と機能を維持するのに役立ちます。 E.両方を含むため、結合された生体触媒システム大腸菌 HjLADまたはSpNoxをL-キシルロース生産の複数のサイクルを有効にするには、アルギン酸カルシウムビーズに固定化した保有する細胞（ 図2）【選択固定化生体触媒システムは、7サイクル後の最初のサイクルの変換収率の65％を維持し、良好な動作安定性を実証しました連続的な再使用、フリー電池システムは、ほぼ完全にその触媒活性を失っています。
Protocol
Representative Results
Discussion
最近の技術の進歩は、バイオテクノロジー産業における市場価値の緩やかな上昇をもたらし、組換え生物学的治療薬の商業化の急増を有効にしています。そのような進歩は、スケーラブルな産業システム38の確立に大きな期待を示している組換え微生物中で代謝工学の出現です。ほとんどのプロセスと同様に、遺伝子操作された微生物により産生された組換え生体分子の成功した商業…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、文部科学省、科学技術（NRF-2013R1A1A2012159とNRF-2013R1A1A2007561）、建国大学、化学工学やMCubed省によって資金を供給、韓国の国立研究財団（NRF）を介して基礎科学研究開発プログラムによってサポートされていましたミシガン大学のプログラム。
Materials
| LB broth | Sigma Aldrich | L3022-6X1KG | |
| Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-10G | |
| Tris base | Fisher | BP1521 | |
| B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma Aldrich | N7004-1G | |
| L-Arabinitol | Sigma Aldrich | A3506-10G | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 168149 | |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 320501-500ML | |
| Carbazole | Sigma Aldrich | C5132 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Sodium alginate | Sigma Aldrich | W201502 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Excella E24 shaker incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendrof | ||
| Beakers | Fisher | ||
| Syringe | Fisher | ||
| Needle | Fisher | ||
| Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance | Ohaus |
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