Imobilização de Multi-biocatalisadores em alginato Beads para Cofator Regeneração e melhorada Reutilização

Summary

Apresentado é o protocolo para biocatalisadores de célula inteira co-imobilização para a regeneração de cofactor e melhorada a capacidade de reutilização, utilizando a produção de L-xilulose como um exemplo. A regeneração cofator é conseguido acoplando duas estirpes de Escherichia coli que expressam enzimas funcionalmente complementares; a imobilização de células inteiras biocatalisador é conseguido por encapsulação de células em esferas de alginato de cálcio.

Abstract

Nós desenvolvemos recentemente um sistema de célula inteira biocatalítica simples, reutilizável e acoplado com a capacidade de regeneração do cofactor e imobilização biocatalisador para melhorar o rendimento de produção e a síntese sustentada. Aqui descrita é o procedimento experimental para o desenvolvimento de um tal sistema constituído por dois E. estirpes de E. coli que expressam enzimas funcionalmente complementares. Em conjunto, estas duas enzimas podem funcionar co-operacionalmente para mediar a regeneração de cofactores caros para melhorar o rendimento do produto do bio-reacção. Além disso, o método de síntese de uma forma imobilizada do sistema biocatalítica acoplado por encapsulação de células inteiras em esferas de alginato de cálcio é relatado. Como um exemplo, apresenta-se a melhoria da biossintese da L-xilulose a partir de L-arabinitol por acoplamento E. células de E. coli que expressam as enzimas desidrogenase L-arabinitol ou NADH oxidase. Sob condições ideais e usando uma concentração inicial de 150mM de L-arabinitol, o rendimento máximo de L-xilulose atingiu 96%, o que é mais elevado do que os relatados na literatura. A forma imobilizada dos biocatalisadores de célula inteira acoplados demonstrou boa estabilidade operacional, mantendo 65% do rendimento obtido no primeiro ciclo após 7 ciclos sucessivos de re-utilização, enquanto que o sistema de célula livre perdeu quase completamente a actividade catalítica. Portanto, os métodos descritos aqui fornece duas estratégias que podem ajudar a melhorar a produção industrial da L-xilulose, bem como outros compostos de valor acrescentado que requerem o uso de co-factores em geral.

Introduction

Biotransformação de célula inteira redutora usando microorganismos tornou-se um método generalizado para a síntese quimio-enzimática de biomoléculas comercialmente e terapeuticamente importantes ^{1 – 3.} Ele apresenta várias vantagens sobre a utilização de enzimas isoladas, particularmente, a eliminação dos processos de purificação a jusante custo intensivo e a demonstração de um tempo de vida prolongado ^4-7. Para vias biocatalíticas onde são necessários co-factores para a formação do produto, os sistemas de célula inteira tem o potencial para proporcionar a regeneração in situ de cofactor através da adição de baixo custo dadores de electrões co-substratos ^5,8,9. No entanto, esta capacidade é diminuída para reacções que requerem uma concentração estequiométrica de co-substratos raras ou caras ^{10 – 13.} Juntamente com a pobre reutilização de células inteiras, o que impede o estabelecimento de um produ escalável e contínuasistema cção. são necessárias modificações estratégica dos sistemas de células completas para estas biotransformações dependente do cofactor para superar as limitações acima mencionadas. Especificamente, a combinação de biocatalisadores de célula inteira que trabalham cooperativamente foram mostrados para aumentar significativamente a produtividade e a estabilidade das enzimas abrigavam ^14. Estes factores, que são frequentemente críticos para permitir a produção em grande escala de produtos comercialmente viáveis, ainda pode ser optimizada por micróbios biocatalíticas co-imobilização ^15. Recentemente, desenvolvemos um sistema biocatalítico de células inteiras simples e reutilizável que permite tanto a regeneração cofator e imobilização biocatalisador para a produção de L-xilulose ^16. Neste estudo, este sistema foi utilizado como um exemplo para ilustrar os procedimentos experimentais de aplicar estas duas estratégias para melhorar o rendimento da produção e a capacidade de reutilização biotransformação biocatalisador.

L-xilulose pertence a uma CLAss de moléculas biologicamente úteis chamado açúcares raros. Açúcares raros são monossacarídeos originais ou derivados de açúcar que ocorrem muito raramente na natureza, mas desempenham um papel crucial como elementos de reconhecimento em moléculas bioativas ^17,18. Eles têm uma variedade de aplicações que vão desde adoçantes, alimentos funcionais para agentes terapêuticos potenciais ^19. L-xilulose pode ser utilizado como um inibidor potencial de várias a-glucosidases, e pode também ser usado como um indicador de hepatite ou cirrose hepática ^17,20. Conversão de alta eficiência de xilitol a L-xilulose em sistemas de célula completa tem sido relatado previamente em Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. 701B ^23, Bacillus pallidus Y25 ^24,25 e Escherichia coli ^26. Em E. coli, no entanto, só foi conseguido utilizando (<67 mM) concentrações baixas de xilitol ^26, devido a possíveis efeitos inibidores de uma concentração inicial xilitol superiores a 100 mM sobre a atividade xilitol-4-desidrogenase ^21,26. O equilíbrio termodinâmico entre xilulose e xilitol tem sido demonstrado que favorecem fortemente a formação de xilitol ^25,27. Além disso, o rendimento de xilulose é limitada pela quantidade de cofactores caros que têm de ser fornecidos, na ausência de um sistema de co-factor de regeneração in situ. Juntos, esses fatores limitam o potencial para a expansão em sistemas sustentáveis ​​para a biossíntese de L-xilulose.

Para superar essas limitações e melhorar o rendimento biotransformação L-xilulose, a estratégia de regeneração cofator foi empregado pela primeira vez através do estabelecimento de um sistema biocatalítico de célula inteira acoplado. Especificamente, L-arabinitol 4-desidrogenase (EC 1.1.1.12) a partir de Hypocrea jecorina (HjLAD), uma enzima na via catabólica de L-arabinose de fungos, foi selecionado para catalisar a conversão de L-arabinitol em L-xilulose ^28,29 . Como muitas enzimas biossintéticas, um dos principais limitatioN de HjLAD é que ele requer uma quantidade estequiométrica do caro nicotinamida adenina dinucleótido cofactor (NAD ^+, a forma oxidada de NADH) para efectuar esta conversão. NADH oxidase encontrado em Streptococcus pyogenes (SpNox) foi mostrado para exibir actividade de cofactor de alta-regeneração ^30,31. Aproveitando este atributo de SpNox, E. células coli que expressam HjLAD para a produção de L-xilulose foram acoplados com E. células coli que expressam SpNox para a regeneração do NAD ⁺ para aumentar a produção de L-xilulose representado pela reacção acoplado mostrado na Figura 1A. Sob condições ideais e usando uma concentração inicial de mM de L-arabinitol 150, o rendimento máximo de L-xilulose atingiu 96%, tornando este sistema muito mais eficiente do que os relatados na literatura.

A estratégia de imobilização de célula inteira foi utilizado ao lado de aumentar ainda mais a capacidade de reutilização do biocatalyt acopladosistema IC. Métodos comumente usados ​​para a imobilização de células inteiras incluem adsorção / o encadeamento covalente a matrizes sólidas, a reticulação / arrastamento e encapsulamento em redes poliméricas ^32. Entre estas abordagens, o método mais adequado para a imobilização de células é encapsulamento em pérolas de alginato de cálcio. Suas propriedades de gelificação leves, matriz aquosa inerte e alta porosidade ajudar a preservar as propriedades fisiológicas e funcionalidade dos produtos biológicos encapsulados ^33. Portanto, o sistema de biocatalisador acoplado contendo tanto E. células de E. coli que abrigam HjLAD ou SpNox foi imobilizado em pérolas de alginato de cálcio para permitir que vários ciclos de produção de L-xilulose (Figura 2) .O sistema de biocatalisador imobilizado demonstrou boa estabilidade operacional, mantendo 65% do rendimento de conversão do primeiro ciclo após 7 ciclos de sucessiva reutilização, enquanto que o sistema de célula livre perdeu quase completamente a sua actividade catalítica.

Protocol

1. Whole-cell Biocatalisadores Preparação NOTA: O E. recombinante coli que abrigam pET28a- SpNox 31 ou pET28a- HjLAD 28 são doravante referida como E. coli e E. SpNox coli HjLAD, respectivamente. Inocular uma única colônia de E. coli HjLAD em 3 ml de meio suplementado com canamicina (50 ug / ml) de Luria-Bertani (LB) e incubar num incubador agitador de O…

Representative Results

Para permitir a co-factor de regeneração, a síntese de L-xilulose foi realizada num sistema de célula inteira biocatalítica acoplado contendo E. coli e E. HjLAD coli SpNox. Após a optimização de vários parâmetros, a capacidade de reutilização do sistema foi melhorada por meio da imobilização que em pérolas de alginato de cálcio (Figura 2). <p class="jove_content" fo:keep-together.withi…

Discussion

Recentes avanços tecnológicos têm permitido um aumento na comercialização de biotherapeutics recombinantes, resultando em um aumento gradual no seu valor de mercado na indústria de biotecnologia. Um tal avanço é o advento da engenharia metabólica em microorganismos recombinantes, que tem mostrado uma grande promessa no estabelecimento de sistemas industriais escaláveis ^​​38. Tal como acontece com a maioria dos processos, o sucesso na comercialização de biomoléculas recombinantes produzidas po…

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus