Cet article présente une méthode pratique et rapide pour la visualisation de différentes populations de cellules neuronales dans le système nerveux central d'embryons de xénope utilisant immunofluorescence sur des coupes.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
Chez les vertébrés, le développement du système nerveux central comprend plusieurs étapes distinctes consécutives encore. La première étape est l'induction neurale, lorsque les cellules ectodermiques naïves sont spécifiés vers un destin neuronal à un destin plutôt que épidermique. Plusieurs mécanismes de régulation interconnectés sont impliqués au cours de cette étape dans d' autres systèmes modèles 1,2 Xenopus et. Ce processus est principalement coordonné par des facteurs sécrétés produits par le mésoderme sous – jacent, comme chordin, caboche et follistatine 3-7. Après l'induction neurale, un sous-ensemble de cellules progénitrices neurales quitter le cycle cellulaire et commencent à se différencier en un processus appelé neurogenèse primaire. Pas tous les précurseurs neuronaux se différencient en ce moment. Les cellules précurseurs neurales restantes continuent à proliférer, maintenant ainsi le pool de cellules souches nécessaires à la croissance continue du système nerveux central au cours du développement et à l'âge adulte.
Ces proliferating cellules précurseurs neurales sont caractérisées par leur expression de la SRY (sex région déterminant Y) -box 3 (SOX3) gène 8-11. L'autre population de cellules, qui sortent du cycle cellulaire et engager à un destin différencié, sont identifiés par l'expression des marqueurs de gènes de différenciation, la tubuline, bêta 2B classe IIb (tubb2b, N-baignoire) et la myéline facteur de transcription 1 (Myt1) 12-14. De telles cellules neuronales différenciées donnent finalement naissance à différentes catégories de neurones , y compris, mais sans s'y limiter, le moteur, inter et les neurones sensoriels positionnés dans des zones distinctes à l' intérieur du tube neural 15-17.
Bien que des efforts importants ont été consacrés à la découverte des mécanismes réglementaires qui régissent la structuration et le destin de déterminer les événements dans la neurectoderme antérieure, moins d'attention a été faite sur enquête sur les événements qui se produisent neurogène après laétape initiale de mise en forme. En effet, la transduction du signal, les règlements de transcription, ainsi que des modifications post-traductionnelles sont tous impliqués dans cette étape plus tard, contrôlant à la fois la spécification de synchronisation et de la lignée pendant la neurogenèse 18-20. D'autres enquêtes sur ces mécanismes nécessitent une méthode fiable pour visualiser facilement et distinguer les différentes populations de cellules neuronales. La N-baignoire marqueurs neuronaux, y compris, SOX3, Myt1 mentionné ci-dessus, et, peut fournir un moyen pour identifier ces populations de cellules différentes, fournissant ainsi les bases nécessaires pour révéler les mécanismes sous – jacents de la différenciation neuronale 21-23.
Bien que l' étiquetage différentiel des populations de cellules neuronales ont été démontrées dans d' autres organismes modèles, relativement peu d' études ont exploité le système Xenopus à son maximum à cet égard. Ceci est principalement dû à un manque d'anticorps compatibles qui permettent d'identifier de manière fiable les différents neurpopulations cellulaires onnelle dans le tube neural. Ici, nous décrivons une méthode pour visualiser la différenciation neuronale dans les premiers embryons de xénope via immunocoloration, qui fournit une approche robuste et pratique pour étudier la neurogenèse primaire dans Xenopus. Ce protocole devrait donner des indications suffisantes pour les chercheurs intéressés par le développement précoce du système nerveux central Xenopus entre l' étape 26 et l' étape 45.
Ici , nous démontrons une méthode pratique et efficace pour la visualisation de la neurogenèse primaire dans des embryons de xénope. Cette méthode permet l'évaluation de différents types de cellules neurales, y compris des cellules souches neuronales et les neurones primaires différenciées en utilisant des marqueurs spécifiques d'un type cellulaire.
Le protocole est généralement robuste avec un très haut niveau de reproductibilité. Pour les embryons qui sont à des stades pré-incubation (soit jusqu'à mettre en scène 28), nous vous recommandons de retirer manuellement la membrane vitelline avant la fixation car cela permet embryons à défriser complètement avant fixation. Ceci est particulièrement important lors de la collecte des embryons à un stade relativement précoce (avant l'éclosion), étant donné que les embryons courbées sont extrêmement difficiles à organiser à l'orientation désirée à l'intérieur de la chambre de montage. On n'a pas connu une perte d'immunogénicité après MEMFA ou PFA fixation donc étape supplémentaire de récupération de l'antigène est pas nécessaire pour ce protocole. En outre, cetteProcédure d'immunocoloration peut être réalisée dans des échantillons provenant chromogénique / hybridation fluorescente in situ. Dans un tel scénario, il est recommandé de sauter l'étape K de traitement de protéase au cours du protocole d'hybridation in situ. Après la réaction chromogénique / fluorescence, les échantillons peuvent être lavés avec du TBS et noyées dans une solution de gélatine de poisson d'une manière similaire à MEMFA / PFA échantillons fixes. Les flacons d'échantillon peuvent être protégés de la lumière en enveloppant les flacons dans une feuille d'aluminium si hybridation fluorescente in situ sera imagée avec immunofluorescence plus tard.
Dans certains cas, les embryons peuvent rétrécir excessivement après la pénétration de la gélatine. Ceci est très probablement causée soit par une fixation insuffisante ou insuffisante extraction TBS-Triton. Veiller à ce que les embryons ont été corrigés dans PFA / MEMFA pendant au moins 2-3 heures ou de préférence pendant une nuit à 4 ° C. Si le problème persiste, augmenter le temps de lavage TBS-Triton à 3 pendant 1 heure.
Au cours de la cryo-sectioning, la rigidité du bloc d'échantillon peut varier selon les différents lots de gélatine de poisson ont des propriétés différentes. Ce problème peut être partiellement compensée par le réglage de la température du microtome. Une température plus basse se traduira par une "plus difficile" bloc d'échantillons mais à basse température excessive du bloc d'échantillon devient croustillant et difficile à section. Certains réglage fin ou de la pratique (à l'aide des blocs d'échantillons simulés sans embryons) avant chaque tronçonnage peut être bénéfique avant utilisation sur des échantillons particulièrement précieux.
Un problème fréquemment rencontré lors de tronçonnage est les sections minces ont parfois tendance à coller sur la plaque de verre épaisse plutôt que de rester à plat sur la scène de l'acier. Cela peut être particulièrement perturbant, car il interrompt constamment le processus de sectionnement continu. De tels cas sont généralement causés par l'une des deux raisons: la chambre de section et (surtout) la plaque de verre épais pour ne pas être une charge statique assez froid, ou excessive sur la machine et l'opérateur, surtout par temps sec. Le premier peut être résolu en baissant la température de la chambre de section et en laissant la plaque de verre à l'intérieur du temps supplémentaire (éventuellement la nuit); et le second par terre correctement le cryostat. Raccordement de la surface métallique du cryostat à un robinet en métal ou similaire système de tuyauterie d'eau en métal peut être une autre façon de libérer les charges statiques. Après chaque utilisation, la plaque de verre épaisse doit être bien lavé avec un détergent non corrosif (par exemple en tant que liquide de lavage de vaisselle), on le rince par de l'eau ultra-pure, pulvérisé avec de l'éthanol pur, et enveloppé dans du papier de serviette pour protéger la surface et les bords d'endommager.
Les anticorps énumérés dans le protocole sont généralement spécifiques et nous rencontrons rarement l'adsorption non spécifique ou d'un signal de fond élevé. Il convient de noter que, en cas d'utilisation de sérum de chèvre / agneau inactivé à la chaleur comme agent de blocage, la chaleur excessive-inactivation (comme visualisé par la formation de précipitants pelucheux dans le sérum) devraitéviter que cette précipitation est très attrayant pour les anticorps secondaires et peut contribuer à une source de bruit de fond élevé.
Il est possible, et parfois souhaitable, pour effectuer double coloration pour visualiser les différentes populations de cellules neuronales simultanément. Cette double coloration est possible et donne des résultats satisfaisants avec les combinaisons suivantes: généralement SOX3 / N-baignoire ou Myt1 / N-baignoire. Cependant, la double coloration des SOX3 et Myt1 est compliquée par le fait que les deux anticorps sont tous deux d'origine du lapin. Nous avons testé plusieurs kits de marquage direct d'anticorps, mais pas des résultats satisfaisants ont été observés (faible niveau de signal-bruit), probablement en raison de l'absence d'amplification du signal à partir d'anticorps secondaires. Une approche possible de contourner ce problème serait d'augmenter lignées transgéniques dans Xenopus, comme discuté ci – dessous.
L'une des principales restrictions de ce protocole est que, alors que ce protocole pourrait suffisamment distinguish deux principaux pools de cellules neuronales, à savoir, la neuronal pool de cellules souches SOX3 exprimant et les neurones différenciés Myt1 exprimant, il n'a pas la capacité de révéler les différentes sous-populations de neurones différenciés. Ces sous-populations, y compris, mais sans s'y limiter, les neurones moteurs primaires, les interneurones et les neurones sensoriels, sont généralement caractérisés par leurs gènes marqueurs différentiellement exprimés 28-30. Comme mentionné ci – dessus, les progrès récents dans le développement de multicolor hybridation in situ combinée avec la méthode de détection d'immunofluorescence à base d' anticorps dans des embryons de Xenopus pt peuvent combler le vide pour révéler ces sous-populations de neurones différenciés pour enquête potentielle 31. En variante, comme cela a été démontré dans le modèle de souris, il serait également souhaitable de soulever un ensemble plus complet d'anticorps spécifiques de type cellulaire pour distinguer ces différentes populations cellulaires chez Xenopus.
C'estégalement à noter que, comme un ajout à cette méthode, les progrès récents dans l' imagerie optique et l' analyse d'image, telles que la microscopie multiphotonique, reconstruction 3D, et la segmentation, peuvent également être appliquées après des évaluations initiales pour parvenir à des observations plus complètes des ovocytes de Xenopus ainsi que embryons précoces, en particulier dans le cadre d' une mise en 32,33 en direct. Par conséquent, pour suivre la prolifération, la différenciation, et le mouvement des cellules neuronales dans les animaux vivants, il serait souhaitable d'établir une ou plusieurs lignées transgéniques qui abritent des protéines fluorescentes entraînées par cellule promoteur spécifique de type pour permettre l' observation en direct de ces populations de cellules au début de Xenopus embryons. La mise en place d'un X. ligne laevis avec spécifiques neuro β-tubuline promoteur conduite tauGFP et ses applications ont fourni un bel exemple 23,34. Avec les séquences de promoteur complète des deux SOX3 et Myt1 caractérisé en vertébrés 35-37, il est should être relativement facile d'établir des lignées transgéniques supplémentaires dans Xenopus qui devraient contribuer largement à la fois la communauté Xenopus et un domaine plus général de la recherche de la neurogenèse primaire.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Professeur Michael Klymkowsky à l'Université du Colorado à Boulder et le professeur Nancy Papalopulu à l'Université de Manchester pour fournir gracieusement des anticorps anti-SOX3 et anti-Myt1, respectivement. Nous remercions les membres du laboratoire Papalopulu pour leurs suggestions pertinentes dans l'élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par deux Fondation pour la guérison de stagiaire à SZ et JL, deux subventions de projet de la Fondation pour la guérison à SZ / EA et JL / EA respectivement, subvention du Wellcome Trust à EA (WT082450MA) un programme, et une subvention d'appui stratégique institutionnel du Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |