En snabb metod för blodbehandlings att öka utbytet av plasmapeptidnivåer i Människoblod
Summary
RAPID blod behandlingsmetod kan användas i människor och ger högre peptidnivåer samt möjliggör en bedömning av den korrekta molekylära formen. Därför kommer denna metod vara ett värdefullt verktyg i peptid forskning.
Abstract
Forskning inom födointag reglering allt viktigare. Detta inkluderar ofta mätning av peptider som reglerar födointag. För korrekt bestämning av en peptid koncentration, bör det vara stabilt under blodbehandlingen. Detta är dock inte fallet för flera peptider som snabbt bryts ned av endogena peptidaser. Nyligen har vi utvecklat en blodbearbetningsmetod som utnyttjar R educed temperaturer, A cidification, P rotease inhibition, jag sotopic exogena kontroller och D ilution (RAPID) för användning i råttor. Här har vi etablerat denna teknik för användning på människor och undersökte återhämtning, molekylär form och cirkulerande koncentration av födointag reglerande hormoner. RAPID metoden förbättrats avsevärt återhämtningen för 125I-märkt somatostatin-28 (+ 39%), glukagonliknande peptid-1 (+ 35%), acyl ghrelin och glukagon (+ 32%), insulin och kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), leptin(+ 21%) och peptid YY 3-36 (+ 19%) jämfört med standardbehandling (EDTA-blod på is, p <0,001). Högprestandavätskekromatografi visade elueringen av endogent acyl ghrelin vid den förväntade positionen efter RAPID bearbetning, medan efter schablon bearbetning 62% av acyl ghrelin nedbröts vilket resulterar i en tidigare topp sannolikt representerar desacyl ghrelin. Efter en snabb behandling acyl / desacyl ghrelin förhållandet i blod hos normalviktiga personer var 1: 3, jämfört med 1:23 följande standardbehandling (p = 0,03). Också endogena kisspeptin nivåer var högre efter RAPID jämfört med standardbehandlingen (+ 99%, p = 0,02). RAPID blod behandlingsmetod kan användas på människor, ger högre peptidnivåer och möjliggör en bedömning av den korrekta molekylära formen.
Introduction
Mot bakgrund av den globala ökande förekomsten av fetma 1,2 bedrivs forskning inom födointag reglering allt viktigare. Medan hittills bara en peptid är känt att perifert produceras och centralt verkande för att stimulera födointag, nämligen ghrelin 3, under de senaste decennierna, har ett brett spektrum av peptider identifierats som minskar födointag, t.ex.. leptin, peptid YY (PYY) och även glukagonliknande peptid-1 (GLP-1) och insulin fyra, därför i studier som undersöker de reglerande mekanismerna för hunger och mättnad peptidnivåer ofta utvärderas och samtidigt antas att peptiden studerades är stabil och återvinnas vid höga utbyten under plasmabildningen. Men detta är mycket ofta inte fallet på grund av snabb endogen nedbrytning som visats tidigare för t ex. ghrelin som nedbrytes från acyl till desacyl ghrelin 5. Därför beskrev vi nyligen snabb metod för blod processjunga i råttor utnyttjar R educed temperaturer, A cidification, P rotease inhibition, jag sotopic exogena kontroller och D ilution 6. Denna metod förbättrade återhämtning för 11 av 12 peptider testade och tillåtna för bestämning av den korrekta cirkulerande molekylär form jämfört med standardblodbehandlings (EDTA-blod på is) 6. Denna metod har använts i flera efterföljande studier 7-12 för detektion av cirkulerande ghrelin liksom kortikotropin-frisättande faktor 13. Därför har metoden visat sig vara användbara för peptidforskning hos gnagare. Eftersom studier på gnagare är inte alltid att överföra till en annan art, metoden bör fastställas för användning i humanblod också.
Syftet med denna studie var att testa snabb metod för blodbehandling hos människor jämfört med standardblodbehandling, EDTA blod på is, som ofta rekommenderas 14 och ofta used i den kliniska liksom inställning forskning. Vi testade återvinning av ett urval av 125 I-märkta peptider som är involverade i regleringen av födointaget inklusive etablerade peptider samt nya kandidater nyligen föreslagits spela en roll i att livnära förordningen (effekter på födointag visas i tabell 1) efter bearbetning med båda metoderna. Hormoner har också valts för att representera peptider av olika längd och laddning (tabell 2). Dessutom för ghrelin vi undersökte den molekylära formen (s) efter standarden och snabb metod. Slutligen bedömde vi endogena ghrelin (acyl och desacyl ghrelin) samt kisspeptin nivåer, en peptid också nyligen föreslagits att spela en roll i regleringen av födointaget 15,16 efter RAPID eller standardbehandling. Dessutom undersökte vi också dessa peptidnivåer i en population av individer med ett brett spektrum av kroppsmasseindex (som sträcker sig från 10,2 till 67,6 kg / m 2) för att studera possible skillnader i samband med kroniskt förändrad kroppsvikt.
Diagnos, bedömning, och Plan:
studiedeltagarna
Alla deltagarna i studien var nyligen på sjukhus patienter (integration var inom två dagar för tillträde till sjukhuset) av divisionen av psykosomatisk medicin vid Charité-Universitätsmedizin Berlin och gav skriftligt informerat samtycke. För att undvika effekterna av kön endast kvinnliga patienter ingick. Totalt 42 försökspersoner deltog i denna studie och delades in i tre grupper: normal vikt (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervösa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) och fetma (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorektisk och överviktiga patienter vardiagnostiseras i enlighet med International Classification of Diseases-10 och på sjukhus för viktökning (anorexia nervosa) eller viktminskning (fetma), respektive. Alla normalviktiga patienter på sjukhus uteslutande på somatoforma symtom utan relevanta somatiska sjukdomar. Patienter med gastrointestinala somatoforma symtom eller en historia av gastrointestinal kirurgi uteslöts. Uteslutningskriterier omfattade också en ålder <18 år, aktuell graviditet och obehandlade psykossjukdomar. blodinsamling utfördes på dag 2 eller 3 efter sjukhus entré före mottagning av kostbehandling i syfte att öka eller minska kroppsvikten, respektive. Antropometriska parametrar bedömdes på samma dag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterade tidigare att snabb metod för blodbehandling förbättrade återhämtning för 11/12 peptider jämfört med standardblodbehandlings hos råttor 6. I den aktuella studien har vi visat att denna metod lämpar sig också för användning på människor. Efter en snabb behandling, var återhämtningen för 9 av 9 125 I-märkta peptider testade förbättrats jämfört med standardblodbehandlings (EDTA-blod på is). Den observerade förbättringen varierade från 19 till 39%, vilket sanno…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den tyska Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) och tyska ministeriet för utbildning och forskning 03IPT614A (CG). Vi tackar Reinhard Lommel och Petra Busse för deras utmärkta teknisk support samt Karin Johansson och Christina Hentzschel för hjälp med organisationen och genomförandet av antropometriska mätningar
Materials
| diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
Referências
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. . Principles of Biochemistry. , (1973).
