Glycan Node analyse: En bottom-up tilnærming til glycomics

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Glykolipider, glykoproteiner, proteoglykaner og glykosaminoglykaner utgjør de fire hovedklasser av komplekse, heterogene karbohydrater kollektivt kjent som glykaner. Som allestedsnærværende og integrerte komponenter av plasmamembranen, glycocalyx, og ekstracellulær matriks og væsker, glykaner delta i slike forskjellige biokjemiske prosesser som endocytose, intracellulær handel, celle motilitet, signaltransduksjon, molekylær gjenkjennelse, reseptoraktivering, celleadhesjon, vert-patogen interaksjon , inter kommunikasjon, immunosurveillance, og immunrespons innvielse. ¹ Tilstede i nesten hvert domene for livet, enzymer som kalles glycosyltransferases som bygger sukker polymerer handle i tandem med glycoside hydrolaser (også kjent som glycosidases, som bryter ned glykaner) for å konstruere, oppussing, og til slutt produserer ferdigstilt sukker polymerer ^2. Selv om hver glykosyltransferase kan operere på forskjellige glycoconjugates, en glykosyltransferasevanligvis ildfaste en linkage- og anomer-spesifikke glykosidbinding ved overføring av monosakkarid-delen av en spesiell aktivert nukleotid-sukkerdonor (f.eks, GDP-fucose) til en bestemt kategori av nukleofile akseptorer (f.eks, et lipid, polypeptid, nukleinsyre, eller vokser oligosakkarider). Det har blitt anslått at mer enn 50% av proteiner (spesielt membran og sekretoriske proteiner) er post-translatorisk modifisert ved glykosylering ³ Rudimentære kombinatoriske beregninger gi en forståelse for den betydelige variasjon, allsidighet og spesifisitet tilstås glykoproteiner av glykosylering.; for eksempel, hvis et polypeptid substrat har bare 10 glykosyleringsseter, og hvert område kan danne en glykosidisk binding med en av bare tre forskjellige monosakkariden reduserende ender, da, teoretisk sett, den endelige glykoprotein kan anta 3 ¹⁰ = 59049 forskjellige identiteter. I glykoproteiner, glykosidiske bindinger som vanligvis dannes med en sidekjede nitrogen of asparaginrester i sekvensen Asn-X-Ser / Thr (X kan være enhver aminosyre bortsett fra prolin), hvilket ga N -glycans ² og sidekjede hydroksyler av serin og treoninrester, hvilket ga O -glycans ^4. Sammensetningen av en celle glycome (dvs. dens komplement av glykolyseringsmetoder produkter) er unikt og begrenset fordi, med få unntak, glycosyltransferases stille strenge donor, akseptor, og sammenhengen spesifisitet. ⁵ viktige og rikelig blodplasma glykoproteiner lider avvik glykosylering som en nedstrøms konsekvens av unormal glykosyltransferase-ekspresjon og aktivitet på grunn av mange patologiske tilstander, spesielt cancer og inflammatoriske sykdommer. ^6-24

Hovedsakelig på grunn av epigenetiske faktorer, er det glycome betydelig mer mangfoldig, dynamisk og komplekst enn proteomet og transkriptom. ^25,26 Mens ca 1% av pattedyr genom koder formasjonen, modifikasjon, ogmontering av glykaner, for ²⁷ glykosylering forløper i et ikke-mal-drevet måte-en markert kontrast polypeptid og nukleinsyre biosyntese. Samspillet mellom den relative mengde og aktivitet av glykolyseringsmetoder enzymer og slike miljøfaktorer som næringsstoff og forløper tilgjengelighet til slutt bestemmer innholdet, hastighet og omfanget av glykosylering. ^5,28 embryogenese (f.eks, besluttsomhet og differensiering), cellulær aktivering og progresjon gjennom cellecyklusen innflytelse genekspresjon (dvs. transkripsjon og translasjon) og endre identiteten og mengden av tilgjengelige glycosyltransferases, hvis aktivitet er den umiddelbare oppstrøms determinant av cellens glykan profil. Fordi (noen av) den proliferative, lim og invasive egenskapene til kreftceller likne de ordinære embryoceller, konkrete endringer i sukker biosyntetiske baner (f.eks forløper akkumulering, deregulert uttrykk, aberrant modifikasjon, strukturelle trunkering, eller roman dannelse) tjene som universelle kreft biomarkører som indikerer ulike stadier av tumordannelse, progresjon, migrasjon og invasjon ²⁹ Selv om glykosylering er svært sammensatt, tydeligvis bare noen få endringer i glykosylering kan aktivere kreftutvikling og metastasering.; tilsynelatende, visse "avvikende" glykolyseringsmetoder produkter faktisk nytte kreftceller ved å sette dem i stand til å unngå immun anerkjennelse og overleve kravene til migrasjon i ugjestmilde intravaskulære og metastatiske miljøer. ^28,30,31 Ikke overraskende har eksperimenter vist at å forstyrre eller hindre mønstre endret genekspresjon og avvikende sukkerdannelse kan stoppe tumorigenesis. ²⁹ Likevel, avvikende glykaner påvist i en biofluid prøve (f.eks, urin, spytt og blod plasma eller serum) er kanskje ikke direkte indikatorer på kreft (eller en annen sykdom), men heller nedstrøms resultatene av subtile ennå betydeligendringer i immunsystemet eller målbare konsekvenser av en skadelig tilstand i en uforutsigbar organ. ³²

Selv om de gir universell informasjon om glycome, mange molekylære interaksjonsbaserte glycomics teknikker (f.eks lectin / antistoff arrays og metabolsk / kovalente merking) avhengig av påvisning av hele sukkerstrukturer og gir ikke detaljert strukturell informasjon om de enkelte glykaner. I sterk kontrast, kan massespektrometri (MS) bidra til å identifisere og kvantifisere enkelte sukkerstrukturer og avsløre slike strukturinformasjon som feste områder til polypeptid kjerner. Deregulert uttrykk eller aktivitet av bare en glykosyltransferase kan sette i gang en kaskade av skadelige molekylære hendelser i flere glykosylering veier. Fordi hver glykosyltransferase kan operere på mer enn én glykokonjugat underlaget og på tvers av ulike voksende sukker polymerer, deregulerte biosyntetiske kaskader gi dispropornalt økte mengder bare en sukker produkt, men flere heterogene klasser av avvikende glykaner i intra- eller ekstracellulære væsker. ³³ Men slike unike avvik glykaner er ofte ansett upraktisk som biomarkører for kreft eller andre sukker-affektive sykdommer fordi, i forhold til det store bassenget av velregulert glykaner, disse avvikende glykaner representerer en svært liten andel som kan ofte være umulig å oppdage selv av slike svært sensitive teknikker som massespektrometri. For eksempel, i intra- og ekstracellulære kroppsvæsker, kan den brede proteinkonsentrasjon-spektrum (som spenner over åtte størrelsesordener) forhindre deteksjon av knappe glykoproteiner som er maskert av de mer vanlige arten. ³² Videre bestemmelse av glykosyltransferase-aktivitet fortsatt en betydelig praktisk og teoretisk utfordring fordi mange glycosyltransferases er fraværende i kliniske biofluids eller blir inaktive ex vivo. Til tross for vanskelighetene med consistently oppdage og kvantifisere ultra-ørsmå mengder av unike hele glykaner, er utøvere av massespektrometri gjort enorme framskritt mot å ansette intakte glykaner som kliniske markører. Vi har nylig utviklet en komplementær tilnærming til analyse av intakte glykaner som, ved anvendelse av GC-MS, letter påvisningen av alle bestand gren-punkt og koblings-spesifikke monosakkarider ( "glykan noder") som sammen bibringe unikhet til hver glykan og i mange tilfeller direkte tjene som molekyl surrogater som kvantifiserer den relative aktivitet av skyldig glykosyltransferase (r).

Siden sin første rapporterte direkte søknad til sukkeranalyse i 1958, har gasskromatografi (GC) påvist en kraftig teknikk for å analysere per-metylert mono- og disakkarider, ³⁴ bestemme sin anomericity og absolutt konfigurasjon, og skille dem for senere massespektrometrisk analyse. ³⁵ mellom 1984 og 2007, Ciucanu og kollegerinnført og raffinert en fast-fase glykan permethylation teknikk som benyttes natriumhydroksid og jodmetan, etterfulgt av væske / væske ekstraksjon av permethylated glykaner med vann og kloroform. ^35,36 Mellom 2005 og 2008, Kang og medarbeidere integrert en tidsbesparende spin -column tilnærming inn i permethylation trinn. ^37,38 i 2008 Goetz forskergruppen utviklet en kvantitativ fast-fase permethylation glykan-profilering metode med matrise-assistert laser desorpsjon-ionisering (MALDI) massespektrometri for å sammenligne og potensielt skille invasiv og non -invasive brystkreft celler, ³⁹ da, i 2009, Goetz teamet kombinert enzymatisk og kjemiske utslipp teknikker for å spalte O -glycans fra intakte glykoproteiner i en svært alkalisk fast-fase permethylation ordningen ⁴⁰ Selv om Goetz prosedyren kles samtidig permethylation og kjemisk utgivelse. av O -glycans, ble det bare brukt på pre-isolerte glycoproteiner. Vi endret denne teknikken i 2013 og tilpasset den for hele ufraksjonerte biofluids og prøver homogenis vev ved å innlemme trifluoreddiksyre (TFA) hydrolyse, reduksjon, og acetylering trinn. ³³ Disse ekstra trinn også frigjøre glykaner fra glykolipider og N -bundne glykaner fra glykoproteiner og konvertere dem inn i delvis metylert alditol acetater (PMAAs, figur 1), hvis karakteristiske metylering-og-acetylering mønstre lette analyse ved GC-MS og entydig kjennetegner de konstituerende glykan nodene i den opprinnelige intakte glykan polymer ⁴¹ (figur 2). ³³ til slutt, denne Fremgangsmåten måten~~POS=HEADCOMP frembringer en sammensatt portrett av alle glykaner i et kompleks biofluid basert på direkte, relativ kvantifisering av unike glykan funksjoner som "kjerne fucosylation", "6-sialylering", "halverer GlcNAc", og "beta 1-6 forgrening" – hver avledet fra en enkelt GC-MS Chromatogrhic topp. Denne artikkelen presenterer ytterligere optimalisering av permethylation, acetylering, isolasjon og oppryddings etapper sammen med forbedringer i modus for relativ kvantifisering.

Protocol

Forsiktig: Unngå hud / øyekontakt med en hvilken som helst av de reagenser som brukes i dette eksperimentet. Ved eksponering, grundig skylle det berørte området med vann og kontakt lege med en gang. 1. Permethylation og Glycan Extraction kolonne Forberedelse Få så mange mikrofuge spinnkolonne heter som prøvene som skal analyseres. Bryt og ta av plastbeholderen pipe cap. Plasser en mikro mini filter i hvert reservoar rør. Plasser de monterte mikrofuger…

Representative Results

En total ionestrøm kromatogram (TIC) som viser vellykket permethylation, hydrolyse, reduksjon, og acetylering av humane blodplasmaprøver i forhold til tilfeller hvor to kritiske permethylation trinn ble utført på feil måte er vist i figur 3. Absolutt Yield av HexNAcs forhold til heksoser: N -acetylhexosamine (HexNAc) delvis de…

Discussion

Generelt sett er vellykket produksjon av delvis metylerte alditol acetater (PMAAs) fra heksoser fylt med færre problemer og er mer robust enn en vellykket produksjon av N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Den eksakte mekanismen bak dette fenomenet som det utspiller seg i alle trinn i denne prosedyren er ukjent, men må forholde seg til den unike kjemien av N-acetyl-gruppen (heller enn hydroksylgruppe) som er unik for HexNAcs forhold til heksoser. Mekanismen bak dette fenomenet som gjelder syrehydrolys…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.