This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.
Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.
Glykolipider, glykoproteiner, proteoglykaner och glykosaminoglykaner utgör de fyra huvudklasser av komplexa, heterogena kolhydrater kollektivt kallas glykaner. Som överallt förekommande och integrerade delar av plasmamembranet, glykokalyx, och extracellulär matris och vätskor, glykaner delta i så skilda biokemiska processer som endocytos, intracellulär trafficking, cellmotilitet, signaltransduktion, molekylär igenkänning, receptoraktivering, cellvidhäftning, värdpatogen interaktion , intercellulär kommunikation, immunosurveillance och immunsvar initiering. 1 närvarande i nästan alla områden i livet, enzymer som kallas glykosyltransferaser som bygger glykan polymerer agera i tandem med glykosid hydrolaser (även känd som glykosidaser som bryter ner glykaner) att bygga, renovera, och slutligen producerar färdig glykan polymerer 2. Även om varje glykosyltransferas kan verka på olika glykokonjugat, en glykosyltransferasallmänhet förfalskar ett redskap, som och anomer specifika glykosidbindning genom överföring av monosackarid-delen av en speciell aktiverad nukleotid sockerdonator (t.ex. GDP-fukos) till en viss kategori av nukleofila acceptorer (till exempel, en lipid, polypeptid, nukleinsyra, eller odling oligosackarid). Det har uppskattats att mer än 50% av proteiner (speciellt membran och sekretoriska proteiner) är posttranslationellt modifierat genom glykosylering 3 rudimentära kombinatoriska beräkningar ger en uppskattning för den stora variationen, mångsidighet och specificitet tillerkänns glykoproteiner av glykosylering. till exempel om en polypeptid substratet har endast 10 glykosyleringsställen och för varje plats kan bilda en glykosidbindning med en av endast tre olika monosackarid-reducerande ändarna, då, teoretiskt, den slutliga glykoprotein kan anta 3 10 = 59049 distinkta identiteter. I glykoproteiner, glykosidbindningar bildas vanligen med sidokedjan kväve of asparaginrester i sekvensen Asn-X-Ser / Thr (X kan vara vilken aminosyra som helst med undantag för prolin) för att ge N-glykaner 2 och sidokedjan hydroxyler serin- och treoninrester för att ge O-glykaner 4. Sammansättningen av en cells glycome (dvs dess komplement av glykosyleringsprodukter) är unik och begränsad eftersom, med få undantag, glykosyltransferaser uppvisar strikt donator, acceptor, och länk specificitet. 5 Viktigt och rikliga blodplasma glykoproteiner lider avvikande glykosylering som en nedströms följd från onormal glykosyltransferas expression och aktivitet på grund av många patologiska tillstånd, speciellt cancer och inflammatoriska sjukdomar. 6-24
Främst på grund av epigenetiska faktorer är glycome betydligt mer mångsidig, dynamisk och komplex än proteomet och transkriptom. 25,26 medan cirka 1% av däggdjursgenomet kodar bildning, modifiering ochmontering av glykaner, till 27 glykosylering fortskrider i en icke-mallbaserade sätt, en skarp kontrast polypeptid och nukleinsyra biosyntesen syra. Samspelet mellan den relativa mängden och aktiviteten av glykosyleringsenzymer och sådana miljöfaktorer som näringsämnen och föregångare tillgänglighet slutligen bestämmer naturen, hastighet och omfattning av glykosylering. 5,28 embryogenesen (t.ex. bestämning och differentiering), cellulär aktivering, och progression genom cellcykeln påverkar genuttryck (dvs transkription och translation) och ändra identiteten och mängden av tillgängliga glykosyltransferaser, vars verksamhet är direkt uppströms faktorn för cellens glykan profil. Eftersom (en del av) det proliferativa, gummering och invasiva egenskaper hos cancerceller liknar dem för vanliga embryogena celler, specifika förändringar i glycan biosyntetiska vägar (t.ex. ackumulering prekursor, avreglerad expression, aberrant modifiering, strukturell trunkering, eller ny formation) fungerar som universella cancer biomarkörer som indikerar olika stadier av tumörbildning, progression, migration och invasion 29 Även glykosylering är mycket komplex, tydligen bara några förändringar i glykosylering kan aktivera cancer och metastaser. tydligen vissa "avvikande" glykosyleringsprodukter verkligen gynnar cancerceller genom att ge dem möjlighet att undvika immunigenkänning och överleva krav migration i ogästvänliga intravaskulära och metastaserande miljöer. 28,30,31 Inte överraskande, har experiment visat att störa eller förhindra mönster förändras genuttryck och avvikande glykan bildning kan stoppa tumörbildning. 29 Trots de avvikande glykaner upptäckts i en biofluid prov (t.ex. urin, saliv, och blodplasma eller serum) får inte vara direkta indikatorer på cancer (eller annan sjukdom), utan snarare nedströms resultaten av subtil men ändå betydandeförändringar i immunsystemet eller mätbara konsekvenserna av en fördärvlig tillstånd på ett oförutsägbart organ. 32
Även om de ger allmän information om glycome många molekylär interaktion baserade glycomics tekniker (t.ex. lektin / antikropps matriser och metabolisk / kovalent märkning) beror på att upptäcka hela glykanstrukturer och inte ge detaljerad strukturell information om enskilda glykaner. I skarp kontrast, kan masspektrometri (MS) hjälpa till att identifiera och kvantifiera individuella glykanstrukturer och avslöja sådan strukturinformation som bindningsställen till polypeptid kärnor. Avreglerad expression eller aktivitet av endast ett glykosyltransferas kan initiera en kaskad av skadliga molekylära händelser i flera glykosylerings vägar. Eftersom varje glykosyltransferas kan arbeta på mer än ett glykokonjugat substrat och mellan olika växande glykan polymerer, avreglerade biosyntetiska kaskader ger dispropornellt ökade mängder av endast en glykan produkt men flera heterogena klasser av avvikande glykaner i inträ- eller extracellulära vätskor. 33 Sådana unika avvikande glykaner anses ibland opraktiska som biomarkörer för cancer eller andra glykan-affektiva sjukdomar eftersom, jämfört med den stora poolen av välreglerad glykaner dessa avvikande glykaner utgör en mycket liten del som ofta kan förbli odetekterbara även genom sådana känsliga metoder som masspektrometri. Till exempel i intra- och extracellulära kroppsvätskor, kan den breda proteinkoncentration spektrum (som spänner över åtta storleksordningar) förhindra upptäckt av knappa glykoproteiner som är maskerade av rikligare arter. 32 Vidare bestämma glykosyltransferas aktivitet fortfarande en avsevärd praktisk och teoretisk utmaning eftersom många glykosyltransferaser är frånvarande i kliniska Biofluids eller blir inaktiva ex vivo. Trots svårigheten av jämn,tly detektera och kvantifiera ultra små mängder av unika hela glykaner, har utövare av masspektrometri gjort enorma framsteg mot att använda intakta glykaner som kliniska markörer. Vi har nyligen utvecklat ett komplement till den analys av intakta glykaner som sysselsätter GC-MS, underlättar upptäckt av alla ingående gren-punkt och kopplingsspecifika monosackarider ( "glykan noder") som tillsammans ger unika för varje glykan och i många fall direkt tjäna som molekylära surrogat som kvantifierar den relativa aktiviteten för den klandervärt glykosyltransferas (er).
Sedan dess första rapporterade direkt ansökan till glykan analys 1958 har gaskromatografi (GC) visat sig vara en kraftfull teknik för att analysera per-metylerade mono- och disackarider, 34 bestämma deras anomericity och absolut konfiguration, och skilja dem för senare analys masspektrometrisk. 35 mellan 1984 och 2007, Ciucanu och kollegorinfört och förfinat en fast fas glykan permetylering teknik som användes natriumhydroxid och jodmetan, följt av vätska / vätske-extraktion av permetylerad glykaner med vatten och kloroform. 35,36 Mellan 2005 och 2008, Kang och medarbetare integrerat en tidsbesparande spin kolonn tillvägagångssätt i permetylering steg. 37,38 Under 2008 Goetz forskargrupp tagit fram en kvantitativ fast fas permetylering glykan-profilering metod som använder matrisassisterad laserdesorption-jonisering (MALDI) masspektrometri att jämföra och eventuellt skilja invasiva och icke -invasive bröstcancerceller, 39 sedan, år 2009, den Goetz laget kombinerad enzymatisk och släppteknik kemiska att klyva O-glykaner från intakta glykoproteiner i en starkt alkalisk fast fas permetylering schema 40 Även om Goetz förfarande underlättas samtidig permetylering och kemisk release. av O-glykaner, var det endast tillämpas på pre-isolerade glykoproteiner. Vi ändrade denna teknik under 2013 och anpassat det för hela ofraktionerade Biofluids och homogeniserad vävnadsprover genom att införliva trifluorättiksyra (TFA) hydrolys, reduktion och acetylering steg. 33 Dessa ytterligare steg också släppa glykaner från glykolipider och N-kopplade glykaner från glykoproteiner och konvertera dem i delvis metylerade alditol acetater (PMAAs, Figur 1), vars utmärkande metylering-och-acetylering mönster underlättar analys av GC-MS och unikt karaktärisera de ingående glykan noderna i den ursprungliga intakta glykan polymer 41 (Figur 2). 33 Ytterst detta förfarande ger en sammansatt porträtt av alla glykanema i en komplex biofluid baserad på direkt, relativ kvantifiering av unika glykan funktioner som "kärn fukosylering", "sex-sialylering", "skär GlcNAc" och "beta 1-6 förgrening" – varje härledd från en enda GC-MS chromatographic topp. I denna artikel presenteras ytterligare optimering av permetylering, acetylering, isolering och saneringssteg tillsammans med förbättringar i läge av relativ kvantifiering.
I allmänhet är framgångsrik produktion av delvis metylerade alditol acetater (PMAAs) från hexoser fylld med färre svårigheter och är mer robust än en framgångsrik produktion av N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Den exakta mekanismen bakom detta fenomen som utspelar sig i varje steg av detta förfarande är okänd, men måste relatera till den unika kemi N-acetyl-gruppen (snarare än hydroxylgrupp) som är unik för HexNAcs relativt hexoser. Mekanismen bakom detta fenomen eftersom det gäller…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the College of Liberal Arts and Sciences of Arizona State University in the form of laboratory startup funds to CRB. It was also supported by a grant from Flinn Foundation (Grant No. 1977) and by the National Cancer Institute of the National Institutes of Health under Award Number R33CA191110. JA was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health Postbaccalalureate Research Education Program (PREP) under award number R25GM071798. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
0.9 mL Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps |
1.5 mL polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
2 mL polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0 – 30.0% |
Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep) |
Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. |