Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).
प्रोटीन बहुतायत के नियमन लगभग हर सेलुलर प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन बहुतायत प्रोटीन संश्लेषण और प्रोटीन गिरावट की दर के एकीकरण को दर्शाता है। कई प्रोटीन बहुतायत पर रिपोर्टिंग assays (जैसे, एकल समय बिंदु पश्चिमी सोख्ता, cytometry, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, या विकास आधारित संवाददाता assays के प्रवाह) प्रोटीन के स्तर पर अनुवाद और प्रोटियोलिसिस के सापेक्ष प्रभाव के भेदभाव की अनुमति नहीं है। यह लेख cycloheximide चेस के उपयोग के पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा विशेष मॉडल कोशिकीय यूकेरियोट में प्रोटीन गिरावट का विश्लेषण करने के लिए, Saccharomyces cerevisiae (नवोदित खमीर) का वर्णन है। इस प्रक्रिया में, खमीर कोशिकाओं translational अवरोध cycloheximide की उपस्थिति में incubated हैं। कोशिकाओं की aliquots के बाद और निम्न cycloheximide के अलावा विशिष्ट समय बिंदुओं पर तुरंत एकत्र कर रहे हैं। कोशिकाओं lysed रहे हैं, और lysates के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन से अलग हो रहे हैंr हर समय बिंदु पर प्रोटीन बहुतायत के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। cycloheximide चेस प्रक्रिया सेलुलर प्रोटीन की एक किस्म के स्थिर राज्य की आबादी की गिरावट कैनेटीक्स के दृश्य परमिट। प्रक्रिया प्रोटीन गिरावट पर के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं और पर्यावरणीय प्रभावों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्रोटीन लगभग हर सेलुलर प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कार्य करते हैं। कई शारीरिक प्रक्रियाओं के समय या विशेष परिस्थितियों के तहत एक निर्धारित अवधि के लिए एक विशेष प्रोटीन (या प्रोटीन) की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। जीवों इसलिए नजर रखने और प्रोटीन बहुतायत विनियमित सेलुलर जरूरतों को पूरा करने के लिए 1। उदाहरण के लिए, cyclins (प्रोटीन है कि कोशिकाओं के विभाजन पर नियंत्रण) सेल चक्र के विशिष्ट चरणों में मौजूद हैं, और विनियमित cyclin स्तरों के नुकसान घातक ट्यूमर गठन 2 के साथ संबद्ध किया गया है। प्रोटीन के स्तर को विनियमित सेलुलर जरूरतों को पूरा करने के अलावा, कोशिकाओं misfolded, unassembled, या अन्यथा न्यायपालिका प्रोटीन अणुओं 3 को खत्म करने degradative गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र को रोजगार। प्रोटीन बहुतायत के नियंत्रण दोनों macromolecular संश्लेषण (प्रतिलेखन और अनुवाद) और गिरावट (आरएनए क्षय और प्रोटियोलिसिस) के विनियमन शामिल है। बिगड़ा या अत्यधिक प्रोटीन गिरावट कई विकृतियों के लिए योगदान, कैंसर, सिस्टिक फाइब्रोसिस, neurodegenerative की स्थिति, और हृदय संबंधी विकार 4-8 शामिल है। प्रोटिओलिटिक तंत्र इसलिए बीमारियों 9-12 की एक श्रृंखला के लिए आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों प्रतिनिधित्व करते हैं।
एक ही समय बिंदु पर प्रोटीन का विश्लेषण स्थिर राज्य प्रोटीन बहुतायत के एक स्नैपशॉट प्रदान करता है संश्लेषण या गिरावट के रिश्तेदार योगदान का खुलासा किए बिना (जैसे, पश्चिमी धब्बा 13 से, cytometry 14, या 15 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रवाह)। इसी तरह, विकास आधारित संवाददाता assays के संश्लेषण और गिरावट 15-20 के प्रभावों के बीच भेदभाव के बिना स्थिर एक विस्तारित समय अवधि में राज्य प्रोटीन का स्तर दर्शाते हैं। यह पहले की तुलना द्वारा बहुतायत और, degradative तंत्र (जैसे की विशिष्ट घटकों बाधा औषधीय prote निष्क्रिय के बाद स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर को degradative प्रक्रियाओं का योगदान अनुमान करने के लिए संभव हैasome 21 या एक जीन धारणा बाहर दस्तक गिरावट 13) के लिए आवश्यक हो। Degradative रास्ते में बाधा के बाद स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर में बदलाव प्रोटीन बहुतायत 13 के नियंत्रण के लिए प्रोटियोलिसिस के योगदान के लिए मजबूत सबूत उपलब्ध कराता है। हालांकि, इस तरह के एक विश्लेषण अभी भी प्रोटीन कारोबार के कैनेटीक्स के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। Cycloheximide चेस पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया शोधकर्ताओं समय 22-24 ओवर प्रोटीन गिरावट कल्पना करने की अनुमति देकर इन कमजोरियों पर काबू। इसके अलावा, क्योंकि cycloheximide पीछा निम्नलिखित प्रोटीन का पता लगाने के लिए आम तौर पर पश्चिमी सोख्ता, रेडियोधर्मी आइसोटोप और लंबी immunoprecipitation कदम द्वारा किया जाता है cycloheximide पीछा करने के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं, कई आमतौर पर इस्तेमाल किया पल्स चेस तकनीक है, जो भी प्रोटीन गिरावट 25 कल्पना करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं के विपरीत है।
Cycloheximide के साथ पहली बार एंटी-फंगल उचित एक यौगिक के रूप में पहचान की गई थी26,27 griseus ग्राम पॉजिटिव जीवाणु Streptomyces द्वारा उत्पादित संबंधों। यह एक सेल पारगम्य अणु है कि विशेष रूप ribosomal translocation 28-31 आई द्वारा यूकेरियोटिक साइटोसोलिक (लेकिन organellar नहीं) अनुवाद रोकता है। एक cycloheximide चेस प्रयोग में, cycloheximide कोशिकाओं को जोड़ा जाता है, और कोशिकाओं की aliquots तुरंत और निम्न यौगिक 22 के अलावा विशिष्ट समय बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं। कोशिकाओं lysed रहे हैं, और हर समय बिंदु पर प्रोटीन बहुतायत विश्लेषण किया जाता है, आम तौर पर पश्चिमी धब्बा। cycloheximide के अलावा आत्मविश्वास से प्रोटीन गिरावट के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है निम्नलिखित प्रोटीन बहुतायत में कम हो जाती है। एक अस्थिर प्रोटीन समय के साथ बहुतायत में कमी होगी, जबकि एक अपेक्षाकृत स्थिर प्रोटीन बहुतायत में थोड़ा परिवर्तन प्रदर्शन करेंगे।
चयनात्मक प्रोटीन गिरावट के तंत्र अत्यधिक यूकेरिया भर में संरक्षित किया गया है। क्या प्रोटीन गिरावट के बारे में जाना जाता है की ज्यादातर पहली बार में सीखा थामॉडल कोशिकीय यूकेरियोट, Saccharomyces cerevisiae (नवोदित खमीर) 25,32-36। खमीर के साथ अध्ययन प्रोटीन गिरावट में उपन्यास और महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान जारी रखने की संभावना है। प्रोटीन बहुतायत के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बाद खमीर कोशिकाओं में cycloheximide पीछा करने के लिए एक विधि यहां प्रस्तुत किया है।
इस पत्र में, प्रोटीन गिरावट कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। इस तकनीक को आसानी से तंत्र की एक किस्म द्वारा अपमानित प्रोटीन की एक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है। यह ध्या?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost’s Office and Department of Biology.
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |