Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).
Regolamento di abbondanza di proteine è fondamentale per praticamente ogni processo cellulare. Proteina abbondanza riflette l'integrazione delle aliquote di sintesi proteica e la degradazione delle proteine. Molti saggi di relazioni su abbondanza di proteine (per esempio, in tempo unico punto western blotting, citometria a flusso, microscopia a fluorescenza, o saggi di crescita giornalista-based) non consentono la discriminazione degli effetti relativi di traduzione e proteolisi sui livelli di proteine. Questo articolo descrive l'uso di cycloheximide caccia seguita da Western blotting per analizzare specificamente degradazione delle proteine nel modello eucarioti unicellulari, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito). In questo procedimento, cellule di lievito vengono incubate in presenza di cicloesimide inibitore traduzionale. Aliquote di cellule vengono raccolte subito dopo e in punti temporali specifici seguenti aggiunta di cicloesimide. Le cellule sono lisate, e lisati sono separati da gel di poliacrilammide for analisi Western Blot di abbondanza di proteine in ogni punto. La procedura cicloeximide chase permette la visualizzazione della cinetica di degradazione della popolazione stato stazionario di una varietà di proteine cellulari. La procedura può essere utilizzata per studiare i requisiti genetici per e influenze ambientali sulla degradazione delle proteine.
Le proteine svolgono funzioni cruciali praticamente in ogni processo cellulare. Molti processi fisiologici richiedono la presenza di una specifica proteina (o proteine) per un determinato periodo di tempo o in particolari circostanze. Organismi quindi controllare e regolare l'abbondanza di proteine per soddisfare le esigenze cellulari 1. Ad esempio, cicline (proteine che controllano la divisione cellulare) sono presenti in specifiche fasi del ciclo cellulare, e la perdita di livelli di ciclina regolamentati è stata associata con la formazione di tumore maligno 2. Oltre a regolare i livelli di proteine per soddisfare le esigenze cellulari, le cellule utilizzano meccanismi di controllo della qualità degradativi di eliminare mal ripiegate, non montati, o in altro modo aberranti molecole proteiche 3. Controllo di abbondanza di proteine comporta regolazione sia la sintesi macromolecolari (trascrizione e traduzione) e la degradazione (RNA decadimento e proteolisi). degradazione delle proteine deteriorate o eccessivo contribuisce a molteplici patologie, Tra cui il cancro, fibrosi cistica, malattie neurodegenerative, disturbi cardiovascolari e 4-8. Meccanismi proteolitici rappresentano quindi bersagli terapeutici promettenti per una serie di malattie 9-12.
L'analisi delle proteine in un unico punto di tempo (ad esempio, da Western Blot 13, citometria a flusso 14, o microscopia a fluorescenza 15) fornisce un'istantanea di costante abbondanza di proteine stato senza rivelare i relativi contributi di sintesi o degradazione. Allo stesso modo, le analisi giornalista di crescita a base riflettono costanti i livelli di proteina stato più di un periodo di tempo prolungato senza discriminazioni tra le influenze di sintesi e degradazione 15-20. È possibile dedurre il contributo dei processi degradativi a livelli proteici stato stazionario confrontando abbondanza prima e dopo inibendo componenti specifici del meccanismo degradativa (ad esempio, dal farmacologicamente inattivando la proteasome 21 o buttare giù un gene ipotizzato per essere necessari per la degradazione 13). Un cambiamento nei livelli di proteina regime permanente dopo inibendo percorsi degradativi fornisce una forte evidenza per il contributo della proteolisi per il controllo delle proteine dell'abbondanza 13. Tuttavia, una tale analisi ancora non fornisce informazioni per quanto riguarda la cinetica del turnover proteico. Chase Cycloheximide seguita da western blotting supera queste debolezze, consentendo ai ricercatori di visualizzare la degradazione delle proteine nel tempo 22-24. Inoltre, poiché la rilevazione delle proteine seguente cycloheximide Chase è in genere eseguita da western blotting, isotopi radioattivi e passaggi immunoprecipitazione lunghi non sono necessari per cycloheximide caccia, a differenza di molte tecniche di inseguimento di impulso comunemente utilizzate, che sono anche eseguite per visualizzare la degradazione delle proteine 25.
Cycloheximide è stato identificato come un composto anti-fungine correttalegami prodotte dai Streptomyces batterio gram-positivo griseus 26,27. Si tratta di una molecola cellula-permeabile che inibisce specificamente citosolico eucariote (ma non organelli) Traduzione alterando ribosomiale traslocazione 28-31. In un esperimento cicloesimide chase, cycloheximide viene aggiunta alle cellule, e aliquote di cellule vengono raccolti immediatamente e in punti temporali specifici seguenti aggiunta del composto 22. Le cellule sono lisate, e l'abbondanza di proteine in ogni punto viene analizzato, in genere western blot. Diminuisce in abbondanza di proteine dopo l'aggiunta di cycloheximide può essere tranquillamente attribuita alla degradazione delle proteine. Una proteina instabile diminuirà in abbondanza nel tempo, mentre una proteina relativamente stabile esporrà piccolo cambiamento in abbondanza.
Meccanismi di degradazione delle proteine selettivo sono state altamente conservata in tutta Eukarya. Molto di ciò che si conosce la degradazione delle proteine primo è stato appreso inil modello eucariote unicellulare, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito) 25,32-36. Studi con il lievito sono suscettibili di continuare a fornire spunti nuovi ed importanti nella degradazione delle proteine. Un metodo per cicloesimide inseguimento in cellule di lievito seguita da Western blot di abbondanza di proteine è presentato qui.
In questo documento, un metodo per analizzare la cinetica di degradazione delle proteine è presentato. Questa tecnica può essere facilmente applicata ad una gamma di proteine degradate da una varietà di meccanismi. È importante notare che gli esperimenti cicloesimide chase riferire sulla cinetica di degradazione del pool stato stazionario di una data proteina. Altre tecniche possono essere utilizzate per analizzare la cinetica di degradazione di specifiche popolazioni di proteine. Ad esempio, il destino …
The authors have nothing to disclose.
The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost’s Office and Department of Biology.
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |