Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).
Regulering av protein overflod er avgjørende for nesten alle cellulære prosessen. Protein overflod reflekterer integrering av satsene for proteinsyntese og proteinnedbrytning. Mange analyser rapportering på protein overflod (for eksempel enkelt tidspunkt western blotting, flowcytometri, fluorescens mikroskopi, eller vekstbaserte reporter analyser) tillater ikke diskriminering av de relative effektene av oversettelse og proteolyse på proteinnivå. Denne artikkelen beskriver anvendelsen av cykloheksimid chase etterfulgt av western-blotting for å analysere spesifikt protein degradering i modellen encellede eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær). I denne prosedyren, blir gjærceller inkubert i nærvær av det translasjonelle inhibitor cykloheksimid. Alikvoter av celler ble oppsamlet umiddelbart etter og på bestemte tidspunkter etter tilsetning av cykloheksimid. Celler blir lysert, og lysatene separeres ved polyakrylamidgel-elektroforese for western blot-analyse av proteiner overflod ved hvert tidspunkt. Den cykloheksimid chase fremgangsmåten tillater visualisering av nedbrytningskinetikken til den stabile tilstand befolkningen i en rekke cellulære proteiner. Fremgangsmåten kan anvendes for å undersøke de genetiske krav og miljømessige påvirkninger på proteinnedbrytingen.
Proteiner utfører viktige funksjoner i nesten alle cellulære prosessen. Mange fysiologiske prosesser krever tilstedeværelse av et bestemt protein (eller proteiner) i en definert tidsperiode eller under spesielle omstendigheter. Organismer derfor overvåke og regulere protein overflod å møte cellulære behov 1. For eksempel, cykliner (proteiner som styrer celledeling) er til stede i bestemte faser av cellesyklusen, og tapet av regulerte nivåer cyklin er blitt assosiert med malign tumordannelse to. I tillegg til å regulere proteinnivåer for å dekke celle behov, celler anvende nedbrytende kvalitet kontrollmekanismer for å eliminere misfoldede, usammensatte, eller på annen måte avvikende proteinmolekyler 3. Kontroll av protein overflod innebærer regulering av både makromolekylær syntese (transkripsjon og translasjon) og nedbrytning (RNA forråtnelse og proteolyse). Svekket eller overdreven protein degradering bidrar til flere patologier, Inkludert kreft, cystisk fibrose, nevrodegenerative tilstander, og kardiovaskulære lidelser 4-8. Proteolytiske mekanismer representerer derfor lovende terapeutiske mål for en rekke sykdommer 9-12.
Analyse av proteiner på ett tidspunkt (for eksempel ved western blot 13, flowcytometri 14, eller fluorescens mikroskopi 15) gir et øyeblikksbilde av steady state protein overflod uten å avsløre de relative bidrag fra syntese eller degradering. Tilsvarende vekstbaserte reporter analyser reflektere steady state protein nivåer over en lengre tidsperiode uten å diskriminere mellom påvirkning av syntese og nedbrytning 15-20. Det er mulig å utlede bidraget fra nedbrytende prosesser til steady state proteinnivåer ved å sammenligne overflod før og etter inhibering av bestemte komponenter i den nedbrytende mekanismen (for eksempel ved farmakologisk inaktivere proteasome 21 eller slå ut et gen antatt å være nødvendig for degradering 13). En endring i steady state protein nivåer etter å hemme degraderende trasé gir sterke bevis for bidraget av proteolyse til kontroll av protein overflod 13. Men en slik analyse fremdeles ikke gi informasjon om kinetikken for protein turnover. Cycloheximide chase fulgt av western blotting overvinner disse svakhetene ved å tillate forskere å visualisere protein degradering over tid 22-24. Videre, fordi protein deteksjon følgende cycloheximide jakten er vanligvis utført av western blotting, radioaktive isotoper og lange immunoutfellingsstudier trinnene er ikke nødvendige for cycloheximide jage, i motsetning til mange vanlige puls jage teknikker, som også er utført for å visualisere protein degradering 25.
Cycloheximide ble først identifisert som en forbindelse med anti-sopp riktigbånd produsert av gram-positive bakterien Streptomyces griseus 26,27. Det er en celle-gjennomtrengelig molekyl som spesifikt hemmer eukaryote cytosol (men ikke organellar) oversettelse ved å svekke ribosomalt trans 28-31. I en cycloheximide chase eksperiment, blir cykloheksimid tilsatt til cellene, og porsjoner av celler ble oppsamlet umiddelbart og på bestemte tidspunkter etter tilsetning av forbindelsen 22. Celler blir lysert, og protein overflod ved hvert tidspunkt ble analysert, vanligvis ved western blot. Reduksjoner i protein overflod etter tilsetting av cycloheximide kan trygt tilskrives protein degradering. Et ustabilt protein vil avta i overflod over tid, mens en forholdsvis stabil protein vil oppvise liten endring i overflod.
Mekanismer for selektiv protein degradering har blitt svært konservert gjennom Eukarya. Mye av det som er kjent om proteindegradering ble først lært imodellen encellede eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær) 25,32-36. Studier med gjær er sannsynlig å fortsette å levere nye og viktig innsikt i protein degradering. En metode for cycloheximide jage i gjærceller etterfulgt av western blot analyse av protein overflod er presentert her.
I denne utredningen, er en metode for å analysere proteinnedbrytningskinetikk presentert. Denne teknikken kan lett anvendes på et utvalg av proteiner nedbrytes av en rekke mekanismer. Det er viktig å merke seg at cycloheximide chase eksperimenter rapportere om nedbrytningskinetikken til den stabile tilstand pool av et gitt protein. Andre teknikker kan brukes til å analysere nedbrytningskinetikken av spesifikke populasjoner av proteiner. For eksempel kan den nedbrytende skjebnen til begynnende polypeptider spores av …
The authors have nothing to disclose.
The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost’s Office and Department of Biology.
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |