Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).
Reglering av protein överflöd är avgörande för praktiskt taget varje cellulär process. Protein överflöd återspeglar integrationen av andelen proteinsyntes och proteinnedbrytning. Många analyser rapportering om protein överflöd (t.ex. en enda tidpunkt western blotting, flödescytometri, fluorescensmikroskopi eller tillväxtbaserad reporteranalyser) tillåter inte diskriminering av de relativa effekterna av översättning och proteolys på proteinnivåer. I den här artikeln beskrivs användning av cykloheximid jaga följt av western blotting för att särskilt analysera proteinnedbrytning i modellen encelliga eukaryota, Saccharomyces cerevisiae (knoppande jäst). I detta förfarande är jästceller odlades i närvaro av translationell inhibitor cykloheximid den. Portioner av celler samlas omedelbart efter och vid specifika tidpunkter efter tillsats av cykloheximid. Cellerna lyseras, och lysaten separeras genom polyakrylamidgelelektrofores for western blot-analys av protein överflöd vid varje tidpunkt. Den cykloheximid chase förfarande medger visualisering av nedbrytningskinetiken av det stationära tillståndet population av en mängd olika cellulära proteiner. Förfarandet kan användas för att undersöka genetiska kraven för och miljöpåverkan på proteinnedbrytning.
Proteiner utför viktiga funktioner i praktiskt taget varje cellulär process. Många fysiologiska processer kräver närvaro av ett specifikt protein (eller proteiner) för en bestämd tid eller under särskilda omständigheter. Organismer därför övervaka och reglera protein överflöd att möta cellulära behov 1. Till exempel, cykliner (proteiner som styr celldelningen) är närvarande vid specifika faser av cellcykeln, och förlusten av reglerade cyklin nivåer har associerats med malign tumörbildning två. Förutom att reglera proteinnivåer för att möta cellulära behov, celler använder nedbrytande mekanismer för kvalitetskontroll för att eliminera felveckade, lösa eller på annat sätt avvikande proteinmolekyler 3. Kontroll av protein överflöd innebär reglering av både makromolekylära syntes (transkription och translation) och nedbrytning (RNA förfall och proteolys). Nedsatt eller överdriven proteinnedbrytning bidrar till flera patologier, Inklusive cancer, cystisk fibros, neurodegenerativa tillstånd, och kardiovaskulära rubbningar 4-8. Proteolytiska mekanismer utgör därför lovande terapeutiska mål för en rad sjukdomar 9-12.
Analys av proteiner vid en enda tidpunkt (t.ex. genom western blot 13, flödescytometri 14, eller fluorescensmikroskopi 15) ger en ögonblicksbild av steady state protein överflöd utan att avslöja de relativa bidragen från syntes eller nedbrytning. På samma sätt, tillväxtbaserade reporter analyser reflekterar steady state proteinnivåer under en längre tidsperiod utan att diskriminera mellan påverkan av syntes och nedbrytning 15-20. Det är möjligt att sluta sig till bidrag nedbrytande processer till steady state proteinnivåer genom att jämföra överflöd före och efter att hämma vissa komponenter i den nedbrytande mekanismen (t.ex. genom farmakologiskt inaktivera proteasome 21 eller slå ut en gen som hypotes att krävas för nedbrytning 13). En förändring i steady state proteinnivåer efter att hämma nedbrytande vägar ger starka bevis för bidraget från proteolys kontroll av protein överflöd 13. Men en sådan analys fortfarande inte ge information om kinetiken för proteinomsättningen. Cykloheximid jaga följt av western blotting övervinner dessa brister genom att tillåta forskare att visualisera proteinnedbrytning över tiden 22-24. Vidare, eftersom proteindetektion efter cykloheximid chase utförs typiskt genom western blotting, radioaktiva isotoper och omständliga immunfällningssteg krävs inte för cykloheximid chase, till skillnad från många vanligen använda puls chase tekniker, som också utförs för att visualisera proteinnedbrytning 25.
Cykloheximid identifierades först som en förening med anti-svamp korrektband som produceras av grampositiva bakterien Streptomyces grisens 26,27. Det är en cell genomträngligt molekyl som specifikt hämmar eukaryot cytosoliskt (men inte organeller) översättning genom att försämra ribosomal translokation 28-31. I en cykloheximid chase experiment är cykloheximid sattes till celler, och alikvoter av celler uppsamlas omedelbart och vid specifika tidpunkter efter tillsats av föreningen 22. Cellerna lyseras, och protein överflöd vid varje tidpunkt analyseras, typiskt genom western blöt. Minskningar i protein överflöd efter tillsats av cykloheximid kan tryggt hänföras till proteinnedbrytning. Ett instabilt protein kommer att minska i överflöd över tiden, medan en relativt stabilt protein kommer att uppvisa liten förändring i överflöd.
Mekanismer för selektiv proteinnedbrytning har starkt konserverade hela Eukarya. Mycket av vad som är känt om proteinnedbrytning först lärt sig imodellen encelliga eukaryot, Saccharomyces cerevisiae (knoppande jäst) 25,32-36. Studier med jäst kommer sannolikt att fortsätta att ge nya och viktiga insikter i proteinnedbrytning. En metod för cykloheximid chase i jästceller, följt av western blot-analys av protein överflöd presenteras här.
I detta papper, är en metod för att analysera proteinnedbrytningskinetiken presenteras. Denna teknik kan enkelt tillämpas på en rad olika proteiner bryts ned genom en mängd olika mekanismer. Det är viktigt att notera att cykloheximid chase experiment rapportera om nedbrytningskinetiken av det stationära tillståndet pool av ett givet protein. Andra tekniker kan användas för att analysera nedbrytningskinetiken av specifika populationer av proteiner. Till exempel, kan den nedbrytande öde begynnande polypeptider …
The authors have nothing to disclose.
The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost’s Office and Department of Biology.
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |