JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Published: April 18, 2016
doi:
10.3791/53975
, , ,
1Department of Biology,Ball State University, 2Bioproduct Research & Development,Eli Lilly and Company

Summary

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Abstract

Protein bolluğu Yönetmelik hemen hemen her hücresel süreç için çok önemlidir. Protein bolluk protein sentezi ve protein yıkımı oranları entegrasyonunu yansıtmaktadır. Protein bolluk raporlama birçok tahliller, protein düzeyleri çeviri ve proteoliz göreli etkilerinin ayrımcılığa izin vermez (örneğin, tek zamanlı noktası batı lekeleme, sitometri floresan mikroskobu veya büyüme-temelli muhabir deneyleri akış). Bu makalede, özellikle model, tek hücreli ökaryot protein parçalanmasını analiz etmek batı blot takip sikloheksimid kovalamacanın kullanımını, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) açıklar. Bu prosedürde, maya hücreleri translasyonel önleyicisi sikloheksimid mevcudiyetinde inkübe edilir. Hücrelerin alikotlan sonra siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki özel zaman noktalarında hemen toplanır. Hücreler lizlenir ve lisatlar fo poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılırHer bir zaman noktasında, protein bolluğu Western blot analizini r. sikloheksimid Chase prosedürü hücresel proteinlerin çeşitli sabit durum nüfusun degradasyon kinetiğinin görselleştirme izin verir. Prosedür protein yıkımı üzerinde genetik gereksinimleri ve çevresel etkileri araştırmak için kullanılabilir.

Introduction

Proteinler hemen her hücresel süreçte önemli işlevleri yerine getirir. Pek çok fizyolojik işlem zaman ya da belirli koşullar altında, belirli bir süre için belirli bir protein (ya da proteinlerin) varlığını gerektirir. Organizmalar nedenle izlemek ve hücresel ihtiyaçlarını karşılamak 1 protein bolluğu düzenler. Örneğin, siklinler (hücre bölünmesini kontrol eden proteinler), hücre döngüsünün belirli aşamalarında mevcut olduğu ve düzenlenmiş siklin seviyelerinin kaybı habis tümör oluşumu 2 ile ilişkili olmuştur. Hücresel ihtiyaçlarını karşılamak için, protein düzeylerinin düzenlemenin yanı sıra hücreler, yanlış katlanmış, birleştirilmemiş ya da başka anormal bir protein moleküllerini 3 ortadan kaldırmak için bozundurucu bir kalite kontrol mekanizmaları kullanır. protein oranından kontrol makromoleküler sentezinin (kopya ve çeviri) ve bozulmaya (RNA çürüğü ve proteoliz) hem düzenlenmesini içerir. Bozulmuş veya aşırı protein yıkımı birden patolojilerin katkıdaKanser, sistik fibroz, nörodejeneratif koşullar, ve kalp-damar bozuklukları 4-8 dahildir. Proteolitik mekanizmaları nedenle hastalıkların 9-12 aralığı için gelecek vaat eden terapötik hedeflerini temsil eder.

Tek bir zaman noktasında proteinlerin analizi sentezi veya bozulma göreli katkılarını vermeden kararlı durum proteini bolluğu anlık görüntüsünü sağlar (örneğin, western blot 13 ​​tarafından, sitometri 14 veya floresan mikroskobu 15 akış). Benzer bir şekilde, büyüme göre raportör testleri sentez ve degradasyon 15-20 etkilerini ayırt olmadan uzun bir süre boyunca sabit durum protein seviyesini göstermektedir. Daha önce bolluk karşılaştırarak ve farmakolojik prote inaktive ederek, örneğin parçalayıcı mekanizmasının (belirli bileşenlerini inhibe sonra kararlı durum protein düzeyleri parçalayıcı süreçlerin katkısını anlaması mümkünasome 21 veya varsayılmış bir gen nakavt bozulması 13) için gerekli olduğu. Parçalayıcı yolları inhibe sonra kararlı durum protein düzeylerinde bir değişiklik protein bolluğu 13 kontrolüne proteoliz katkısı için güçlü kanıtlar sağlar. Ancak, bu tür bir analiz de protein döngüsü kinetiği ilişkin bilgi sağlamaz. Batı blot takip Siklohekzimid kovalamaca araştırmacılar zaman 22-24 üzerinde protein parçalanmasını görselleştirmek için izin vererek bu zayıflıkları üstesinden gelir. Sikloheksimid Chase, aşağıdaki protein saptama, batı lekeleme, radyoaktif izotoplar ve uzun immünopresipitasyon aşamalarla gerçekleştirilir, çünkü daha fazla, aynı zamanda protein degradasyonunu 25 görselleştirmek için gerçekleştirilen çok sayıda yaygın olarak kullanılan darbe takip teknikleri, farklı olarak, sikloheksimid Chase gerekli değildir.

Sikloheksimit birinci anti-mantar, uygun olan bir bileşik olarak tanımlanmıştır26,27 griseus gram-pozitif bakteri Streptomyces tarafından üretilen kravatlar. Özellikle ribozomal translokasyonu 28-31 bozarak ökaryot sitozolik (ama organel değil) çeviri inhibe eden hücre geçirgen bir moleküldür. Bir sikloheksimid Chase deneyde, sikloheksimid hücrelere ilave edilir ve hücre numuneleri, hemen ve bileşik 22 ilave edildikten sonra belirli zaman noktalarında alınır. Hücreler lizlenir ve her zaman noktasında bir protein bolluğu tipik western blot ile analiz edilmiştir. güvenle protein yıkımı atfedilebilir siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki proteini bolluğu azaltır. nispeten istikrarlı bir protein bolca az değişiklik gösterecektir sırasında bir kararsız protein, zamanla bolca azalacaktır.

seçici protein yıkımı mekanizmaları son derece ökaryotlarının boyunca muhafaza edilmiştir. protein yıkımı hakkında bilinen çok ne ilk öğrenildiModel tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) 25,32-36. maya ile yapılan çalışmalar protein yıkımı içine yeni ve önemli bilgiler sunmaya devam etmek olasıdır. protein oranından Western blot analizi ile, ardından maya hücrelerinde sikloheksimid Chase bir yöntem sunulmuştur.

Protocol

Maya hücrelerinin 1. Büyüme ve Hasat Bir endojen maya protein degradasyon kinetiği analiz değilse, ilgili proteini kodlayan bir plazmid ile arzu edilen maya suşu (ler) dönüşümü. Maya transformasyonu için güvenilir yöntemler, daha önce 37 tarif edilmiştir. Uygun bir ortamda 5 ml maya inoküle (örneğin, dönüştürülmüş hücreler ya da dönüştürülmemiş hücreler için seçici olmayan bir maya ekstresi-pepton dekstroz (YPD) orta plasmid bakımı için Seç…

Representative Results

Sikloheksimid Chase yöntemi göstermek için, Deg1 -Sec62 stabilitesi (Şekil 1) bir model maya endoplazmik retikulum (ER) -associated bozulması (ERAD) alt-tabaka, 42-44 analiz edilmiştir. ERAD, kalite kontrol ubikuitin ligaz enzimleri kovalent ER zarında lokalize anormal proteinlerin küçük bir protein ubikitinin zincirlerini takın. Böyle polyubiquitylated proteinler daha sonra ER kaldırılır ve proteazom, büyük, sitozolik proteaz 45…

Discussion

Bu yazıda, protein yıkımı kinetik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik hali hazırda çeşitli mekanizmalar ile bozulmuş proteinler, bir dizi uygulanabilir. Sikloheksimid kovalamaca deneyleri belirli bir proteinin kararlı durum havuzunun bozulma kinetiği rapor dikkat etmek önemlidir. Diğer teknikler proteinlerinin spesifik popülasyonlarının degradasyon kinetiğinin analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, doğmakta olan polipeptidlerin parçalayıcı kaderi darbe kovalamaca analizi …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost’s Office and Department of Biology.

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Keywords: Protein DegradationSaccharomyces CerevisiaeCycloheximide ChaseEndogenous ProteinPlasmid-expressed ProteinOptical DensityMid-logarithmic GrowthHeat BlockStop MixCell LysisProtein Denaturation
check_url/pt/53975?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image