الجمع بين نقرا الإسفار<em> في الموقع</em> التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
الكشف عن التعبير الجيني في أنواع مختلفة من خلايا الدماغ على سبيل المثال، الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، قليلة التغصن، السلائف دبقية قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة، التي يمكن أن تعوق عدم وجود الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية محددة لالمناعية. نحن هنا تصف بروتوكول للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات مختلفة في قسم المخ نفسه باستخدام مضان مزدوجة في الموقع التهجين مع تحقيقين جينات محددة تليها المناعية مع الأجسام المضادة من نوعية عالية الموجهة ضد البروتين المشفرة بواسطة الجينات الثالث. ويعتقد أن يتم التعبير عنها قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة ولكن ليس في الخلايا النجمية والخلايا العصبية – وAspartoacyclase (ASPA) الجينات، والطفرات التي يمكن أن تؤدي إلى مرض المادة البيضاء البشري النادر – مرض كانافان. ومع ذلك، لم يتم بعد تأسيس نمط التعبير الدقيق للASPA في الدماغ. وقد سمح لنا هذا البروتوكول لتحديد ما ASPA يتم التعبير في مجموعة فرعية من الخلايا قليلة التغصن ناضجة لالثانية يمكن تطبيقه بصفة عامة إلى مجموعة واسعة من الدراسات نمط التعبير الجيني.
Introduction
تتكون الخلايا الدبقية، وهي الخلايا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، قليلة التغصن (الخلايا myelinating من CNS)، قليلة التغصن السلائف (مكتب خدمات المشاريع، التي تعرف أيضا باسم "خلايا NG2")، الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. هناك اهتمام متزايد في وظائف الخلايا الدبقية وأدوارهم المحتملة في الأمراض العصبية 1. على سبيل المثال، مرض كانافان (CD) هو اضطراب وراثي الاعصاب تبدأ في مرحلة الطفولة مع حثل المادة البيضاء الإسفنجي والفقدان التدريجي للخلايا العصبية في وقت مبكر، مما يؤدي إلى الموت عادة قبل 10 سنة من العمر 2،3. طفرات في الجين Aspartoacyclase (ASPA) التي تؤدي إلى انخفاض شديد في النشاط ASPA 4 في مؤتمر نزع السلاح تم تحديدها. ASPA هو انزيم تحفيز deacetylation من N-acetylaspartate (NAA)، وهو جزيء تتركز بشكل كبير في الدماغ، وتوليد خلات واسبارتاتي 5-7. تظهر العديد من المرضى CD مستويات أعلى من ناه بسبب عدم وجود ASPA ميلانالناقلية. بعض الدراسات أن يخمن خلات المستمدة ناه-يمكن أن تكون مصدرا رئيسيا من الأحماض الدهنية / الدهون في الدماغ أثناء التطور ومؤتمر نزع السلاح قد تنجم عن انخفاض تركيب المايلين خلال تطوير الناجمة عن فشل ناه إلى تقسيمها 3،5،6.
ASPA وجدت في الغالب في الكلى والكبد والمادة البيضاء في الدماغ، ونظرا للدور الهام من الإقليمين في مؤتمر نزع السلاح، وقد درس التعبير الخلوية من هذا الانزيم في الدماغ عن طريق عدة مختبرات. من خلال النظر في النشاط الأنزيمي ASPA في الدماغ، وجدت دراسات سابقة أن الزيادة في النشاط ASPA أثناء نمو المخ يوازي مدار الساعة من تكون الميالين 8-10. على المستوى الخلوي، المقايسات للنشاط الأنزيمي وكذلك الموقع التهجين (ISH) والمناعية (IHC) في التحليلات تشير إلى أن ASPA يعبر عنها بشكل رئيسي في الخلايا قليلة التغصن في الدماغ ولكن ليس في الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية 11-16. وقد وجدت بعض الدراسات أن ASPA ربما أيضايمكن التعبير عنها في الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي 12،14. بيانات حتى الآن على التعبير ASPA في مكتب خدمات المشاريع محدودة. وفقا لدراسة حديثة حيث تم تحليل ترنسكربيتوم من أنواع مختلفة من الخلايا في قشرة الدماغ الماوس بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، مكتب خدمات المشاريع، قليلة التغصن التي شكلت حديثا، myelinating قليلة التغصن، الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية، وpericytes التي كتبها RNA التسلسل 17، وأعرب عن ASPA حصرا في الخلايا قليلة التغصن ، ولا سيما في myelinating قليلة التغصن (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). وعلى الرغم من هذه الدراسات على نمط التعبير ASPA في الدماغ، لا يزال هناك عدد من الشكوك.
تقنيات مختلفة يمكن استخدامها لدراسة أنماط التعبير الجيني. IHC هو طريقة تستخدم عادة للكشف عن المنتجات وظيفية (أي البروتين) من التعبير الجيني في أقسام الأنسجة. وعلى الرغم من فائدتها كبيرة، وهذا الأسلوب له قيود تطبيقه وخصوصية ور تخضعس توافر ونوعية الأجسام المضادة اللازمة. وعلى سبيل المقارنة، ISH لديها ميزة كونها قادرة على الكشف عن التعبير عن أي الجينات على مستوى مرنا. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون تحديا تقنيا لاستخدام عدة تحقيقات في نفس الوقت من أجل توطين التعبير الجيني لأنواع معينة من الخلايا. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول الجمع مزدوج RNA مضان في الموقع التهجين مع immunolabelling مضان من البروتين. وقد استخدمنا هذه مجموعة من التقنيات لدراسة نمط التعبير عن الإقليمين في مخ الفأر. وتسمح هذه الطريقة دراسة دقيقة في التعبير الجيني باستخدام متحد البؤر المجهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لRNA المزدوج في الموقع التهجين تليها المناعية. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتأكيد أن الإقليمين يعبر عنه قليلة التغصن ناضجة في العديد من مناطق الدماغ.
هذا الإجراء متعددة الخطوات لديه?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
Referências
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
