Kombination Dobbelt Fluorescens<em> In Situ</em> Hybridisering med immunomærkning for Påvisning af ekspression af tre gener i musehjerne Sektioner
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
Påvisning af genekspression i forskellige typer af hjerneceller, f.eks, neuroner, astrocytter, oligodendrocytter, oligodendrocyt prækursorer og mikroglia, kan blive hæmmet af manglen på specifikke primære eller sekundære antistoffer til immunfarvning. Her beskriver vi en protokol til påvisning af ekspression af tre forskellige gener i den samme hjerne afsnittet med dobbeltklæbende fluorescens in situ hybridisering med to genspecifikke prober efterfulgt af immunfarvning med et antistof af høj specificitet rettet mod proteinet kodet af et tredje gen. Den Aspartoacyclase (ASPA) gen, mutationer af hvilket kan føre til en sjælden human hvid substans sygdom – Canavan sygdom – menes at blive udtrykt i oligodendrocytter og mikroglia, men ikke i astrocytter og neuroner. Imidlertid har endnu ikke fastslået den præcise ekspressionsmønsteret for ASPA i hjernen. Denne protokol har givet os mulighed for at afgøre, at ASPA udtrykkes i en delmængde af moden oligodendrocytter ennd det kan generelt anvendes til en bred vifte af genekspression mønster undersøgelser.
Introduction
Gliaceller, som er de mest udbredte celler i centralnervesystemet (CNS), omfatter oligodendrocytter (de myelinerende celler CNS), oligodendrocytter forstadier (OP, også kendt som "NG2 celler"), astrocytter og mikroglia. Der er stigende interesse for de funktioner, gliaceller og deres potentielle rolle i neurologiske sygdomme 1. For eksempel Canavan sygdom (CD) er en arvelig neurodegenerativ lidelse starter tidligt i barndom med spongiform leukodystrofi og et progressivt tab af neuroner, hvilket fører til døden normalt før 10 års alderen 2,3. Mutationer i Aspartoacyclase (ASPA) gen, der fører til drastisk reduceret ASPA aktivitet 4 i CD er blevet identificeret. ASPA er et enzym katalyserer deacetylering af N-acetylaspartate (NAA), et molekyle stærkt koncentreret i hjernen, genererer acetat og aspartat 5-7. Mange CD patienter viser højere niveauer af NAA grund af manglende ASPA acvitet. Nogle undersøgelser spekulere at NAA-afledte acetat kunne være en væsentlig kilde til fedtsyrer / lipider i hjernen under udvikling og CD kan skyldes nedsat myelin syntese under udvikling forårsaget af svigt i NAA opdeles 3,5,6.
ASPA findes overvejende i nyrerne, leveren og hvide substans i hjernen, og i betragtning af den vigtige rolle, som ASPA i CD, har den cellulære ekspression af dette enzym i hjernen blevet undersøgt af flere laboratorier. Ved at se på ASPA enzymatisk aktivitet i hjernen, tidligere undersøgelser vist, at stigningen i ASPA aktivitet under hjernens udvikling paralleller tidsforløbet af myelinering 8-10. På celleniveau, analyser assays for enzymatisk aktivitet samt in situ-hybridisering (ISH) og immunhistokemi (IHC) antyder, at ASPA hovedsagelig udtrykkes i oligodendrocytter i hjernen, men ikke i neuroner eller astrocytter 11-16. Enkelte undersøgelser vist, at ASPA måske ogsåudtrykkes i mikroglia i CNS 12,14. Hidtil data om ASPA udtryk i OP'er er begrænsede. Ifølge en nylig undersøgelse, hvor transcriptomes af forskellige celletyper i mus hjernebarken, herunder neuroner, astrocytter, OP'er, nydannede oligodendrocytter, myelinerende oligodendrocytter, mikroglia, endotelceller og pericytter blev analyseret ved RNA-sekventering 17 er ASPA udelukkende udtrykkes i oligodendrocytter , navnlig i myelinerende oligodendrocytter (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). På trods af disse undersøgelser af ASPA udtryk mønster i hjernen, en række usikkerheder tilbage.
Forskellige teknikker kan anvendes til at studere genekspressionsmønstre. IHC er en almindeligt anvendt fremgangsmåde til påvisning af funktionelt produkt (dvs. protein) af et gen-ekspression i vævssnit. Trods sin store nytte har denne teknik begrænsninger som dens anvendelse og specificitet er underlagt to tilgængeligheden og specificitet af antistoffet nødvendig. Til sammenligning ISH har den fordel at være i stand til at afsløre ekspressionen af ethvert gen på mRNA-niveauet. Men det kan være teknisk udfordrende at anvende flere prober på samme tid for at lokalisere en genekspression til specifikke celletyper. I denne artikel beskriver vi en protokol kombinerer dobbelt fluorescens-RNA in situ hybridisering med fluorescens immunomærkning af et protein. Vi har anvendt dette sæt af teknikker til at undersøge ekspressionsmønsteret for Aspa i musehjerne. Denne fremgangsmåde tillader den præcise undersøgelse af genekspression under anvendelse af konfokal mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver en trin-for-trin procedure for en dobbelt RNA in situ hybridisering efterfulgt af immunfarvning. Vi har brugt denne protokol til at bekræfte, at Aspa udtrykkes i modne oligodendrocytter på flere områder i hjernen.
Denne multi-trins procedure har mange potentielle faldgruber, der kan påvirke følsomhed og bør undgås. Først, alle opløsninger og opbevaring puffere til transkription reaktion skal være RNase-fri. For det andet, at valget af cDNA tem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
Referências
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
