Combinant Double Fluorescence<em> In Situ</em> Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l'expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
La détection de l' expression du gène dans différents types de cellules du cerveau , par exemple, les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes, les précurseurs d'oligodendrocytes et la microglie, peut être entravée par l'absence d'anticorps primaires ou secondaires spécifiques pour immunocoloration. Nous décrivons ici un protocole pour détecter l'expression de trois gènes différents dans la même section du cerveau en utilisant le double fluorescence par hybridation in situ avec deux sondes spécifiques de gènes , suivie par immunocoloration avec un anticorps de haute spécificité dirigée contre la protéine codée par un troisième gène. Le gène Aspartoacyclase (ASPA), les mutations de ce qui peut conduire à une maladie rare de la substance blanche humaine – la maladie de Canavan – est pensé pour être exprimé dans les oligodendrocytes et la microglie , mais pas dans les astrocytes et les neurones. Cependant, le modèle d'expression précise de ASPA dans le cerveau n'a pas encore été établie. Ce protocole nous a permis de déterminer que l'ASPA est exprimé dans un sous-ensemble des oligodendrocytes matures unee peut être généralement appliqué à une large gamme d'études de motif d'expression génique.
Introduction
Les cellules gliales, qui sont les cellules les plus abondantes dans le système nerveux central (SNC), comprennent oligodendrocytes (les cellules myélinisantes du SNC), les oligodendrocytes précurseurs (PO, aussi connu comme «cellules NG2»), les astrocytes et la microglie. Il y a un intérêt croissant dans les fonctions des cellules gliales et leur rôle potentiel dans les maladies neurologiques 1. Par exemple, la maladie de Canavan (CD) est une maladie neurodégénérative héréditaire commençant tôt dans l' enfance avec leucodystrophie spongiforme et une perte progressive des neurones, menant à la mort habituellement avant 10 ans de 2,3 ans. Des mutations du gène Aspartoacyclase (ASPA) qui conduisent à réduire considérablement l' activité ASPA 4 CD ont été identifiés. ASPA est une enzyme catalysant la désacétylation du N-acétylaspartate (NAA), une molécule fortement concentrée dans le cerveau, l' acétate de génération et d' aspartate 5-7. Beaucoup de patients CD présentent des niveaux plus élevés de NAA en raison du manque de ASPA activité. Certaines études avancent que l' acétate NAA dérivé pourrait être une source importante d'acides gras / lipides dans le cerveau au cours du développement et CD peut résulter d' une diminution de la synthèse de la myéline au cours du développement causés par l'échec de NAA être ventilés 3,5,6.
ASPA se retrouve principalement dans les reins, le foie et la substance blanche du cerveau, et étant donné le rôle important de la ZSPA dans le CD, l'expression cellulaire de cette enzyme dans le cerveau a été étudié par plusieurs laboratoires. En regardant l' activité enzymatique ASPA dans le cerveau, des études antérieures ont constaté que l'augmentation de l'activité ASPA au cours du développement du cerveau est parallèle au cours du temps de myélinisation 8-10. Au niveau cellulaire, les tests pour l' activité enzymatique ainsi que l' hybridation in situ (ISH) et immunohistochimie (IHC) dans les analyses suggèrent que l' ASPA est principalement exprimé dans les oligodendrocytes dans le cerveau , mais pas dans les neurones ou des astrocytes 11-16. Quelques études ont montré que ASPA pourrait aussiêtre exprimé dans la microglie dans le SNC 12,14. Jusqu'à présent, les données sur l'expression ASPA dans les PO sont limitées. Selon une étude récente où transcriptomes de différents types de cellules dans le cortex cérébral de souris , y compris les neurones, les astrocytes, ops, oligodendrocytes nouvellement formés, oligodendrocytes myélinisantes, les microglies, les cellules endothéliales et péricytes ont été analysés par séquençage de l' ARN 17, ASPA est exclusivement exprimé dans les oligodendrocytes , en particulier dans myélinisantes oligodendrocytes (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). En dépit de ces études sur modèle d'expression ASPA dans le cerveau, un certain nombre d'incertitudes demeurent.
Différentes techniques peuvent être utilisées pour étudier les profils d'expression des gènes. IHC est une méthode couramment utilisée pour la détection du produit fonctionnel ( par exemple, une protéine) d'une expression génique dans des coupes de tissus. En dépit de sa grande utilité, cette technique a des limites que son application et la spécificité sont sujets to la disponibilité et la spécificité de l'anticorps est nécessaire. Par comparaison, ISH a l'avantage d'être capable de révéler l'expression d'un gène au niveau de l'ARNm. Cependant, il peut être techniquement difficile d'utiliser plusieurs sondes en même temps afin de localiser une expression de gènes à des types cellulaires spécifiques. Dans cet article, nous décrivons un protocole combinant ARN double fluorescence hybridation in situ avec fluorescence immunomarquage d'une protéine. Nous avons utilisé cet ensemble de techniques pour examiner le profil d'expression de Aspa dans le cerveau de souris. Cette méthode permet l'étude précise de l'expression génique en utilisant la microscopie confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour un ARN double hybridation in situ suivie par immunocoloration. Nous avons utilisé ce protocole pour confirmer que Aspa est exprimé dans les oligodendrocytes matures dans plusieurs régions du cerveau.
Cette procédure en plusieurs étapes a de nombreux pièges potentiels qui peuvent affecter la sensibilité et doivent être évités. Tout d'abord, toutes les solutions et tampons de stockage pour la réaction …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
Referências
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
