La combinazione di doppio Fluorescenza<em> In Situ</em> Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
Rilevazione di espressione genica in diversi tipi di cellule cerebrali ad esempio, i neuroni, astrociti, oligodendrociti, precursori degli oligodendrociti e microglia, può essere ostacolato dalla mancanza di specifici anticorpi primari o secondari per immunocolorazione. Qui si descrive un protocollo per rilevare l'espressione di tre diversi geni nella stessa sezione del cervello utilizzando doppia ibridazione in situ fluorescente con due sonde gene-specifici seguiti da immunocolorazione con un anticorpo di alta specificità diretto contro la proteina codificata da un terzo gene. Il gene Aspartoacyclase (ASPA), mutazioni che possono portare a una malattia della sostanza bianca umana rara – malattia di Canavan – è pensato per essere espresso in oligodendrociti e microglia ma non in astrociti e neuroni. Tuttavia, deve ancora essere stabilito il pattern di espressione precisa ASPA nel cervello. Questo protocollo ha permesso di stabilire che ASPA è espresso in un sottogruppo di oligodendrociti maturi unnd può essere generalmente applicata a una vasta gamma di studi pattern di espressione genica.
Introduction
cellule gliali, che sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale (CNS), comprendono oligodendrociti (cellule mielinizzanti di CNS), oligodendrociti precursori (PO, noto anche come "cellule NG2"), astrociti e microglia. Vi è un crescente interesse per le funzioni delle cellule gliali e dei loro ruoli potenziali nelle malattie neurologiche 1. Ad esempio, malattia di Canavan (CD) è una malattia neurodegenerativa ereditaria di partenza nella prima infanzia con leucodistrofia spongiforme e una progressiva perdita di neuroni, che porta alla morte di solito prima dei 10 anni di età 2,3. Le mutazioni nel gene Aspartoacyclase (ASPA), che portano a ridurre drasticamente l'attività ASPA 4 nel CD sono stati identificati. ASPA è un enzima che catalizza la deacetilazione di N-acetilaspartato (NAA), una molecola altamente concentrata nel cervello, acetato di generazione e aspartato 5-7. Molti pazienti CD mostrano livelli più elevati di NAA causa della mancanza di ASPA actività. Alcuni studi ipotizzano che l'acetato NAA-derivato potrebbe essere una delle principali fonti di acidi grassi / lipidi nel cervello durante lo sviluppo e CD può derivare da una diminuzione sintesi della mielina durante lo sviluppo causata dal fallimento di NAA essere ripartiti 3,5,6.
ASPA si trova soprattutto nel rene, fegato e materia bianca del cervello, e dato il ruolo importante ASPA in CD, l'espressione cellulare di questo enzima nel cervello è stato studiato da molti laboratori. Osservando ASPA attività enzimatica nel cervello, studi precedenti hanno trovato che l'aumento dell'attività ASPA durante lo sviluppo cerebrale parallelo l'andamento temporale della myelination 8-10. A livello cellulare, saggi di attività enzimatica e ibridazione in situ (ISH) e immunoistochimica (IHC) analisi suggeriscono che ASPA è espresso principalmente in oligodendrociti nel cervello, ma non nei neuroni o astrociti 11-16. Alcuni studi hanno trovato che ASPA potrebbe ancheessere espresso in microglia nel sistema nervoso centrale 12,14. i dati finora su espressione ASPA OPS sono limitati. Secondo un recente studio in cui trascrittomi di diversi tipi di cellule nel topo corteccia cerebrale compresi i neuroni, astrociti, PO, oligodendrociti di nuova formazione, oligodendrociti mielinizzanti, microglia, cellule endoteliali e periciti sono stati analizzati da RNA sequenziamento 17, ASPA è espresso esclusivamente in oligodendrociti , in particolare nel mielinizzanti oligodendrociti (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Nonostante questi studi sulla ASPA modello di espressione nel cervello, una serie di incertezze rimangono.
Diverse tecniche possono essere utilizzati per studiare gli schemi di espressione genica. IHC è un metodo comunemente utilizzato per rilevare il prodotto funzionale (cioè, proteine) dell'espressione genica in sezioni di tessuto. Nonostante la sua grande utilità, questa tecnica ha limitazioni sua applicazione e specificità sono soggetti to la disponibilità e specificità dell'anticorpo necessaria. In confronto, ISH ha il vantaggio di essere in grado di rivelare l'espressione di un gene a livello di mRNA. Tuttavia, può essere tecnicamente difficile utilizzare più sonde contemporaneamente per localizzare una espressione genica di specifici tipi di cellule. In questo articolo, si descrive un protocollo che combina doppia RNA fluorescente in situ con fluorescenza ibridazione immunolabelling di una proteina. Abbiamo utilizzato questo insieme di tecniche per esaminare il pattern di espressione di Aspa in cervello di topo. Questo metodo permette la preciso studio dell'espressione genica mediante microscopia confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo prevede una procedura passo-passo per un doppio RNA ibridazione in situ seguito da immunocolorazione. Abbiamo usato questo protocollo per confermare che Aspa è espresso in oligodendrociti maturi in diverse aree del cervello.
Questa procedura multi-step ha molti potenziali insidie che possono influenzare la sensibilità e dovrebbero essere evitati. In primo luogo, tutte le soluzioni e buffer di memorizzazione per la reazione di trascrizione devono es…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
Referências
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