Summary

ダブル蛍光を組み合わせます<em>その場で</em>マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

Published: March 26, 2016
doi:

Summary

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Abstract

脳細胞の異なるタイプ、例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体およびミクログリアにおける遺伝子発現の検出は、免疫染色のために特異的な一次または二次抗体の不足によって妨げられることができます。ここでは、第三の遺伝子によってコードされるタンパク質に対する高い特異性の抗体を用いて免疫染色に続いて2遺伝子特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーション二重蛍光を使用して、同じ脳切片における三つの異なる遺伝子の発現を検出するためのプロトコルを説明します。 Aspartoacyclase(ASPA)遺伝子の突然変異は稀な人間白質疾患につながることができます-カナバン病は-オリゴデンドロサイトとミクログリアではなく、星状細胞およびニューロンにおいて発現されると考えられています。しかし、脳内ASPAの正確な発現パターンは、まだ確立されていません。このプロトコルは、ASPAは、成熟オリゴデンドロサイトaのサブセットに発現していることを決定することができましたNDは、一般に、遺伝子発現パターンの研究に広く適用することができます。

Introduction

中枢神経系(CNS)において最も豊富な細胞であるグリア細胞は、希突起膠細胞(CNSのミエリン形成細胞)、オリゴデンドロサイト前駆体(以下、「NG2細胞」としても知られているオプス)、アストロサイト及びミクログリアを含みます。グリア細胞と神経疾患1におけるそれらの潜在的な役割の機能への関心の高まりがあります。例えば、カナバン病(CD)は、年齢2,3の10年前に、通常は死に至る、海綿状白質ジストロフィーとニューロンの進行性の喪失と乳児期早期での出発遺伝性神経変性疾患です。大幅CDにASPAアクティビティ4を減少につながるAspartoacyclase(ASPA)遺伝子の変異が同定されています。 ASPAは、酢酸およびアスパラギン酸5-7を生成 、N-アセチルアスパラギン酸(NAA)の脱アセチル化を触媒する酵素で、非常に脳に集中する分子です。多くのCD患者起因ASPA ACの欠如にNAAのより高いレベルを示しますtivity。いくつかの研究は、NAA由来の酢酸は、開発やCD 3,5,6を破壊するNAAの故障による開発中に減少ミエリン合成に起因する時の脳内の脂肪酸/脂質の主要な供給源であり得ることが推測しています。

ASPAは、主に脳の腎臓、肝臓および白質で発見され、そしてCDで南極特別保護地区の重要な役割を与えられた、脳におけるこの酵素の細胞発現は、いくつかの研究室によって研究されてきました。脳内ASPA酵素活性を調べることによって、以前の研究では、脳の発達の間ASPA活性の増加は、髄鞘形成8-10の時間経過に匹敵することを見出しました。細胞レベルでは、酵素活性のためだけでなく、in situハイブリダイゼーション(ISH)および免疫組織化学(IHC) でのアッセイは、ASPAは、主に脳内のオリゴデンドロサイトではなく、ニューロンやアストロサイト11月16日に発現していることを示唆している分析します。 ASPAはまたかもしれないことがわかった少数の研究CNS 12,14にミクログリアで発現させること。 OPでASPA発現に対するこれまでのデータは限られています。ニューロン、アストロサイト、OPは、新たに形成されたオリゴデンドロサイト、ミエリンオリゴデンドロサイト、ミクログリア、内皮細胞、および周皮細胞などのマウス大脳皮質における異なる種類の細胞のトランスクリプトームは、RNAの塩基配列決定17で分析した最近の研究によると、 南極特別保護地区はもっぱらオリゴデンドロサイトに発現しています、特にオリゴデンドロサイトのミエリン中(http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html)。脳内のASPA発現パターンに、これらの研究にもかかわらず、不確定要素の数が残っています。

別の技術は、遺伝子発現パターンを研究するために使用することができます。 IHCは、組織切片における遺伝子発現の機能的産物( すなわち、タンパク質)を検出するために一般的に使用される方法です。そのアプリケーションおよび特異性は、対象トンであるため、その大きな有用性にもかかわらず、この手法には限界があります必要な抗体の利用可能性と特異O。比較により、ISHは、mRNAレベルでの任意の遺伝子の発現を明らかにすることができるという利点を有します。しかしながら、特定の細胞型への遺伝子の発現を局在化するために、同時に複数のプローブを使用することは技術的に困難であることができます。この記事では、我々は、タンパク質の蛍光免疫標識とin situハイブリダイゼーション二重蛍光RNAを合成するプロトコルを記述します。我々は、マウス脳におけるアスパの発現パターンを調べるために、技術のこのセットを使用しています。この方法は、共焦点顕微鏡を用いた遺伝子発現の正確な研究を可能にします。

Protocol

倫理の声明: マウスの飼育と取り扱いは、動物(科学的手順)イギリスとその改正規則2012年の法1986に準拠し、英国内務省の規制やUCL倫理委員会のガイドラインに従っています。 注:すべての溶液をジエチルピロカーボネート(DEPC)で作られるべきである – あらゆる残留のRNaseを破壊するために処理された水。 DEPC処理のため、すべてのDEPC球はDEPCを分解するために?…

Representative Results

この記事では、マウス脳切片における免疫標識に続いて二重蛍光ISHのための方法を説明します。このプロトコルの簡単な説明は、最初のステップは、 アスパおよびMBP(ミエリン塩基性タンパク質 )に特異的なプローブを合成することで、図1に示されています。プローブが合成されたことを確認するには、各反応の小アリコートをアガロー?…

Discussion

このプロトコルは、免疫染色に続いてin situハイブリダイゼーション二重RNAのためのステップバイステップの手順を提供します。我々は、 アスパは、いくつかの脳の領域で成熟したオリゴデンドロサイトに発現していることを確認するために、このプロトコルを使用しています。

この多段階の手順は、感度に影響を与えることができ、避けるべきである多く…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

Materials

QIAprep® Miniprep Qiagen 27104
Deionized formamide Sigma F9037 for ISH blocking buffer
Sodium chloride Sigma S3014
Trizma Base Sigma T1503
Hydrochloric acid VWR International 20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous Sigma S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate Sigma 30435
Yeast tRNA Roche 10109495001
50x Denhardt's solution Life Technologies 750018
Dextran sulfate Sigma D8906
Aspa cDNA clone Source Bioscience IRAVp968C0654D
SalI New England Biolabs R0138
Sodium acetate Sigma S2889
Equilibrated phenol Sigma P4557
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Isoamyl alcohol Aldrich 496200
Ethanol VWR International 20821.321
T7 RNA polymerase Promega P4074
Transcription buffer Promega P118B
100mM DTT Promega P117B
UTP-DIG NTP mix Roche 11277073910
Rnasin Promega N251B
Paraformaldehyde Sigma P6148
Filter paper Fisher scientific 005479470
Sucrose Sigma 59378
Diethyl pyrocarbonate Sigma D5758
Pentobarbitone Animalcare Ltd BN43054
Dissecting scissors World Precision Instruments 15922
25 gauge needle Terumo 300600
Peristaltic pump Cole-Parmer Instrument Co. Ltd WZ-07522-30
Iris scissors Weiss 103227
No.2 tweezers World Precision Instruments 500230
Coronal Brain Matrix World Precision Instruments RBMS-200C
Razor blade Personna Medical PERS60-0138
OCT medium Tissue tek 4583
Cryostat/microtome Bright
Superfrost plus slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Sodium citrate Sigma S4641 for 65°C wash buffer
Formamide Sigma-Aldrich F7503
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Coverslips VWR International 631-0146
Coplin Jar Smith Scientific Ltd 2959
Blocking reagent Roche 11096176001
Heat-inactivated sheep serum Sigma S2263
Hydrophobic pen Cosmo Bio DAI-PAP-S 1:500
α-FITC POD-conjugated antibody Roche 11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System Perkin Elmer NEL741001KT 1:1500
α-DIG AP-conjugated Roche 11093274910
Fast red tablets Roche 11496549001
.22µM filter Millex SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody Millipore AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody Life technologies A-31573 1:1000
bisBenzimide H 33258 sigma B2883
Mounting medium Dako S3023
Leica SP2 confocal microscope Leica

Referências

  1. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  2. Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
  3. Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
  4. Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
  5. Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
  6. Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
  7. Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
  8. D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
  9. Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
  10. Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
  11. Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
  12. Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
  13. Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
  14. Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
  15. Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
  16. Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
  17. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).

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Jolly, S., Fudge, A., Pringle, N., Richardson, W. D., Li, H. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (109), e53976, doi:10.3791/53976 (2016).

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