Kombinera Double Fluorescens<em> In Situ</em> Hybridisering med inmärkning för detektion av uttryck av tre gener i mus hjärnsektioner
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
Detektion av genuttryck i olika typer av hjärnceller, t.ex., neuroner, astrocyter, oligodendrocyter, oligodendrocyt prekursorer och mikroglia, kan hämmas av bristen på specifika primära eller sekundära antikroppar för immunfärgning. Här beskriver vi ett protokoll för att detektera uttrycket av tre olika gener i samma hjärnavsnittet under användning dubbel fluorescens in situ hybridisering med två genspecifika prober, följt av immunfärgning med en antikropp med hög specificitet riktad mot det protein som kodas av en tredje gen. Den Aspartoacyclase (ASPA) genen, mutationer av vilket kan leda till en sällsynt mänsklig vit substans sjukdom – Canavan sjukdom – tros uttryckas i oligodendrocyter och mikroglia men inte i astrocyter och neuroner. Men den exakta uttrycksmönstret av ASPA i hjärnan har ännu inte fastställts. Detta protokoll har tillåtit oss att bestämma att ASPA uttrycks i en delmängd av mogna oligodendrocyter ennd den kan i allmänhet tillämpas på ett brett spektrum av genuttryck mönsterstudier.
Introduction
Gliaceller, som är de mest förekommande celler i det centrala nervsystemet (CNS), består av oligodendrocyter (de myeliniserande cellerna i CNS), oligodendrocyter prekursorer (OP, även känd som "NG2 celler"), astrocyter och mikroglia. Det finns ett växande intresse för funktioner gliaceller och deras potentiella roll i neurologiska sjukdomar 1. Till exempel är Canavan sjukdom (CD) en ärftlig neurodegenerativ sjukdom börjar tidigt i barndomen med spong leukodystrofi och en progressiv förlust av nervceller, vilket leder till döden vanligen före 10 års ålder 2,3. Mutationer i Aspartoacyclase (ASPA) gen som leder till drastiskt minskad ASPA aktivitet 4 i CD har identifierats. ASPA är ett enzym som katalyserar det deacetylering av N-acetylaspartate (NAA), en molekyl mycket koncentrerad i hjärnan, vilket genererar acetat och aspartat 5-7. Många CD patienter visar högre nivåer av NAA grund av brist på ASPA acvitet. Vissa studier spekulerar att NAA-härledda acetat kan vara en viktig källa av fettsyror / lipider i hjärnan under utveckling och CD kan bero på minskad myelinsyntes under utveckling som orsakas av fel i NAA att brytas ned 3,5,6.
ASPA återfinns framför allt i njurar, lever och vita substansen i hjärnan, och med tanke på den viktiga roll som ASPA CD har den cellulära uttryck av detta enzym i hjärnan studerats av flera laboratorier. Genom att titta på ASPA enzymatisk aktivitet i hjärnan, tidigare studier funnit att ökningen av ASPA aktivitet under hjärnans utveckling parallell tidsförloppet för myeline 8-10. På cellnivå, analyser för enzymatisk aktivitet liksom in situ hybridisering (ISH) och immunohistokemi (IHC) analyser tyder på att ASPA huvudsakligen uttrycks i oligodendrocyter i hjärnan men inte i neuroner eller astrocyter 11-16. Några studier har visat att ASPA kan ocksåuttryckas i mikroglia i CNS 12,14. Hittills uppgifter om ASPA uttryck i OPS är begränsade. Enligt en färsk studie där transcriptomes av olika celltyper i musen hjärnbarken inklusive neuroner, astrocyter, OP, nybildade oligodendrocyter, myeliniserande oligodendrocyter, mikroglia, endotelceller och pericyter analyserades med RNA-sekvensering 17, är ASPA uteslutande uttrycks i oligodendrocyter , i synnerhet i myeliniserande oligodendrocyter (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Trots dessa studier ASPA uttrycksmönster i hjärnan, ett antal osäkerheter kvarstår.
Olika tekniker kan användas för att studera gen-uttrycksmönster. IHC är ett vanligt använt förfarande för att detektera den funktionella produkten (dvs protein) av en genexpression i vävnadssnitt. Trots sin stora användbarhet, har denna teknik begränsningar som dess tillämpning och specificitet är föremål to tillgänglighet och specificitet av antikroppen behövs. Som jämförelse har ISH fördelen av att kunna avslöja expressionen av varje gen på mRNA-nivå. Det kan dock vara tekniskt utmanande att använda flera prober samtidigt för att lokalisera en genuttryck till specifika celltyper. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll som kombinerar dubbel fluorescens RNA in situ hybridisering med fluorescens inmärkning av ett protein. Vi har använt denna uppsättning tekniker för att undersöka uttrycksmönstret för Aspa i mushjärna. Denna metod tillåter den exakta studier av genuttryck med användning av konfokalmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll ger en steg-för-steg-procedur för en dubbel-RNA in situ-hybridisering följt av immunfärgning. Vi har använt detta protokoll för att bekräfta att Aspa uttrycks i mogna oligodendrocyter i flera områden i hjärnan.
Detta förfarande i flera steg har många potentiella fallgropar som kan påverka känsligheten och bör undvikas. Först, alla lösningar och lagrings buffertar för transkriptionsreaktionen måste vara RNas-fri. För det andra, är valet av…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
Referências
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
