Çift Floresan birleştiren<em> In Situ</em> Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
Beyin hücreleri, örneğin nöronlar, astrositler, oligodendrositler, oligodendrosit öncüleri ve mikroglia farklı gen ifadesinin saptanması, immün spesifik primer ya da sekonder antikorların yokluğuyla engellenebilir. Burada üçüncü geni tarafından kodlanan proteine karşı yöneltilmiş yüksek özgüllük bir antikor ile immün ardından, iki gen spesifik problar ile in situ hibridizasyon, çift floresan kullanılarak aynı beyin kısmında üç farklı gen ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol açıklar. Aspartoacyclase (ASPA) geni, mutasyonlar nadir insan beyaz madde hastalığı neden olabilir – Canavan hastalığı – oligodendrositler ve mikroglia ancak astrositler ve nöron ifade edilmesi düşünülmektedir. Bununla birlikte, beyinde ASPA kesin ifade deseni henüz belirlenmemiştir zorundadır. Bu protokol ASPA olgun oligodendrosit a bir alt kümesi olarak ifade edildiğini belirlemek için bize izin verdiND genellikle gen ekspresyon paterni çalışmalar çeşitli uygulanabilir.
Introduction
Merkezi sinir sisteminde (CNS) içinde en bol hücrelerdir glial hücreler, oligodendrositlerin (CNS myelinating hücreleri), oligodendrositler öncüleri (aynı zamanda "NG2 hücreler" olarak da bilinir OP), astrositler ve mikroglia içermektedir. Nörolojik hastalıklarda 1 glial hücreler ve bunların potansiyel rolleri fonksiyonları artan bir ilgi vardır. Örneğin, Canavan hastalığı (CD) genellikle yaş 2,3 10 yıl önce ölüme yol açan, erken süngersi leukodystrophy ve nöronların ilerleyici kaybı ile bebeklik döneminde başlayan bir kalıtsal nörodejeneratif bir hastalıktır. Yol Aspartoacyclase (ASPA'nın) genindeki mutasyonlar ölçüde CD ASPA'nın aktivitesi 4 düşürülen tespit edilmiştir. ASPA N-asetilaspartat (NAA) deasetilasyonu katalize bir enzim, yüksek beyin içinde konsantre molekülü üreten asetat, aspartat 5-7. Birçok CD hasta nedeniyle ASPA ac eksikliği NAA daha yüksek olduğunu göstermektedirtivity. Bazı çalışmalar NAA türetilmiş asetat gelişimi sırasında yağ asitleri / beyinde lipidlerin önemli bir kaynağı olabilir ve 3,5,6 aşağı kırılması NAA yetmezliği nedeniyle gelişimi sırasında miyelin sentezi azaldığı CD neden olabilir spekülasyon.
ASPA ağırlıklı beyin böbrek, karaciğer ve beyaz cevherde bulunan ve CD'deki ASPA önemli rolü verilir, beyindeki bu enzimin hücre ifadesi birkaç laboratuvarlar tarafından incelenmiştir. Beyinde ASPA enzimatik aktivite bakarak, daha önceki çalışmalarda beyin gelişimi sırasında ASPA aktivite artışı miyelinasyon 8-10 zaman sürecini paralellik bulundu. Hücresel düzeyde, enzimatik aktivitesi için hem de in situ hibridizasyon (ISH) ve immünohistokimya (IHC) deneyleri ASPA'nın esas olarak beyinde konumlandığı, fakat nöronlar veya astrosit 11-16 oligodentrositler ifade olduğunu göstermektedir analizleri. Birkaç çalışmalarda ASPA da olabilir oCNS 12,14 olarak mikroglia olarak ifade edilebilir. Operasyonel olarak ASPA ifadesine Şimdiye kadar veriler sınırlıdır. Nöronlar, astrositler, OP'lerle, yeni kurulan oligodendrositler, myelinating oligodendrositler, mikroglia, endotelyal hücreler ve perisitlere dahil fare serebral korteks farklı hücre tiplerinin transcriptomes RNA sıralanması 17 ile analiz edildi Yeni bir araştırmaya göre, ASPA sadece oligodendrositlere ifade edilir , oligodendrositlerin myelinating özellikle (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Beyinde ASPA ifade deseni bu çalışmalara rağmen, belirsizliklerin bir dizi kalır.
Farklı teknikler gen ekspresyonu incelemek için kullanılabilir. IHC doku kesitlerinde bir gen ekspresyonunun işlevsel bir ürün (örneğin, protein) tespit etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. uygulama ve özgünlüğü tabi t gibi onun büyük yarar rağmen, bu tekniğin sınırlamaları vardırihtiyaç duyulan antikorun mevcudiyeti ve özgünlüğü o. Buna karşılık, ISH mRNA düzeyinde bir genin ekspresyonunu ortaya çıkarmak mümkün olma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, özel hücre tipleri için bir gen ekspresyonunu lokalize etmek için aynı anda birden fazla prob kullanımı teknik olarak zor olabilir. Bu yazıda, bir proteinin floresan immüno ile in situ hibridizasyon çift floresan RNA birleştiren bir protokol açıklar. Biz fare beyninde Aspa salgılanma modelini incelemek için teknikler bu dizi kullandık. Bu yöntem, konfokal mikroskopi kullanılarak gen ekspresyonunun hassas çalışma sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol immün tarafından takip In situ hibridizasyon çift RNA için bir adım-adım prosedürü sağlar. Biz Aspa birkaç beyin bölgelerindeki olgun oligodendrosit ifade edilmektedir onaylamak için bu protokolü kullanılır.
Bu çok aşamalı prosedür hassasiyetini etkileyebilir ve kaçınılmalıdır pek çok potansiyel tuzaklar vardır. İlk olarak, transkripsiyon reaksiyonu için tüm çözümleri ve depolama tamponlar RNaz ücretsiz olması gerekir. İkinci o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
Referências
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
