عزل خلايا الفأر التاجي غشائي
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
الخلايا البطانية خط الجدار الداخلي للأوعية الدموية، وتلعب دورا هاما في تنظيم لهجة الأوعية الدموية، ونفاذية الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة. تورط خلل الخلايا البطانية في تطور وتقدم العديد من أمراض القلب والشرايين بما في ذلك مرض نقص تروية القلب. لدراسة وظيفة وتوصيف الخلايا البطانية التاجية، والعزلة الخلية هي الخطوة الأولى ويتطلب عالية النقاء وكمية لإجراء تجارب لاحقة. يصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لعزل الماوس الكبار الخلايا البطانية التاجية. يتم تشريح قلب فأر والمفروم إلى قطع صغيرة. بعد هضم القلب باستخدام dispase وكولاجيناز الثاني، يتم غسلها الخلايا وحضنت مع حبات مغناطيسية والتي مترافق مع الأجسام المضادة لمكافحة CD31. حبات مع الخلايا البطانية يتم غسلها عدة مرات ونحن على استعداد لاستخدامها في مختلف التطبيقات، بما في ذلك التصوير وexperime البيولوجي الجزيئياليلة. العزلة الفعالة ينتج ما يقرب من 10 4 خلايا في قلب واحد مع أكثر من 90٪ النقاء.
Introduction
نماذج الماوس من مختلف الأمراض القلبية الوعائية واضطرابات التمثيل الغذائي تحمل التغيرات الفسيولوجية والجزيئية التي هي مماثلة لتلك التي وجدت في المرضى. وعلاوة على ذلك، والتعديلات الجينية من الفئران هو أداة قوية تسمح لنا للتحقيق في دور الممرضة من جينات معينة في تطور وتقدم في جميع الأمراض. في الوقت الحاضر، خلية من نوع معين الجينات تدق في أو تتولد الفئران-خارجا بسهولة في العديد من المختبرات وقياس مرنا ومستويات البروتين في أنواع معينة من الخلايا هي الخطوة الأولى في تحديد ما إذا كانت الفئران كانت حقا المعدلة وراثيا.
البطانة هي طبقة واحدة رقيقة من الخلايا البطانية (ECS) أن خطوط جدار الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا البطانية تلعب دورا حاسما في تنظيم توتر الأوعية الدموية، ونفاذية الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة 1،2. الخلايا البطانية هو السمة المميزة للعديد من الحالات المرضية والتغيرات في وظيفة بطانة الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى السيارة المختلفةالأمراض diovascular 3،4. ومن ثم كبيرا لدراسة وظيفة الخلايا البطانية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.
هناك عدة طرق لعزل ECS 5-8 وأسلوب العزل يجب أن يكون الأمثل اعتمادا على الأنسجة والأنواع سوف تستخدم. وذلك لأن ECS من الأنسجة المختلفة عرض على مستوى عال من عدم التجانس فيما يتعلق علامات سطحها والتعبير البروتين 9. العزلة الناجحة من الخلايا البطانية وغالبا ما تكون صعبة وتتطلب قدرا من التدريب والممارسة. وبمجرد تحقيقه، وطريقة العزل المقترحة في هذا البروتوكول يبرهن على أن تكون مستقرة وفعالة.
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على الماوس التاجي ECS (MCECs) ذات جودة عالية وكمية. على الرغم من أن كمية الخلايا التي تم جمعها من قلب أقل من الخلايا التي تم جمعها من الأنسجة الأخرى باستخدام تقنيات أخرى، فإن هذا الأسلوب لا يزال يوفر الرهانجودة ثالثا. نقاء من الخلايا البطانية في عدد السكان الناتج أكبر من 90٪. وبالتالي، فإن هذه التقنية سيكون مثاليا للتطبيقات التي تعتمد على الخلايا البطانية معزولة بحتة مثل التصوير الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا البطانية الأكثر استخداما على نطاق واسع في مجال البحوث والوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) بسبب الراحة وسهولة زراعة. ومع ذلك، هناك الكثير من الأبحاث يتطلب توافر نموذج الفسيولوجية التي حققتها عزل الخلايا البطانية من أجهزة محددة أخرى 10. الخلايا ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل منحة من المعاهد الوطنية للصحة (HL115578 لألف ماكينو).
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
Referências
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
