鼠标冠状动脉内皮细胞的分离
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
内皮细胞排列的血管的内壁，并在血管张力，血管通透性，及新血管形成的调节中起重要作用。内皮细胞功能障碍在许多心血管疾病，包括缺血性心脏疾病的发生和发展有关。审查功能和冠状内皮细胞的表征，细胞分离是第一步，它需要高纯度和数量进行随后的实验。这个协议描述了一种有效的方法，以分离成年鼠冠状内皮细胞。小鼠心脏解剖，切碎成小块。用分散酶和胶原酶II心脏的消化后，将细胞洗涤并与缀合有抗CD31抗体的磁珠孵育。与内皮细胞的珠洗涤几次，并准备在各种应用中，包括成像和分子生物学experime使用NTS。高效分离得到每一心脏大约10 4细胞有超过90％的纯度。
Introduction
各种心血管疾病和代谢性疾病的小鼠模型承受其类似于那些在患者中发现的生理和分子变化。此外，老鼠的基因的改变是一个强大的工具，使我们能够调查疾病发生和发展的特定基因的致病作用。时下，细胞类型特异性基因敲入或-out小鼠容易在特定的细胞类型许多实验室和mRNA的测定和蛋白水平产生在确定是否将小鼠真正遗传修饰的第一步。
内皮是内皮细胞（EC），该线的内血管壁的薄单层。内皮细胞在调节血管张力，血管通透性，及新血管形成1,2-关键作用。内皮功能障碍是许多病理学病症和血管内皮功能的改变的标志可导致各种汽车diovascular疾病3,4。它是这样显著研究生理和病理生理条件下的内皮细胞的功能。
有几种方法来分离内皮5-8和隔离方法具有这取决于组织和物种将被用来进行优化。这是因为来自不同组织的EC显示异质性的高水平的相对于它们的表面标记和蛋白质表达9。内皮细胞的成功分离往往是具有挑战性的，需要一定程度的培训和实践。一旦实现，在该协议提出隔离的方法证明是稳定的和有效的。
这种方法的总体目标是获得鼠标冠状动脉内皮细胞（MCECs）的高品质和数量。即使细胞从心脏采集的量小于从使用其他技术的其他组织中收集的细胞，该技术仍然提供赌注之三的品质。内皮细胞在所得人口的纯度为大于90％。因此，这种技术将是理想的，依赖于纯粹分离的内皮细胞，如细胞成像应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
在研究中最广泛使用的血管内皮细胞，因为它们方便和易于培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。然而，大量的研究，需要由内皮细胞从其它特定器官10的隔离达到生理模型的可用性。内皮细胞弥补心脏组织细胞的一个很小的群体;其分离和培养可以证明是非常困难的。
有此协议中的三个关键步骤。第一是冲洗血液良好。这是必要的，因为血液中的白细胞也表达CD31作为?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由卫生（HL115578到A牧野）全国学院的资助。
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
Referências
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