Este protocolo está preparado para compartilhar nosso método de isolamento de células endoteliais coronárias de camundongos para fins de imagem ou para conduzir experimentos biológicos moleculares.
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Artigo de método
Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células endoteliais estão alinhados na parede interna dos vasos sanguíneos e desempenham um papel importante na regulação do tónus vascular, da permeabilidade vascular, e nova formação vascular. disfunção das células endoteliais está implicada no desenvolvimento e progressão de muitas doenças cardiovasculares, incluindo doença cardíaca isquémica. Para examinar a função e caracterização de células endoteliais coronárias, o isolamento de células é o primeiro passo e exige elevado grau de pureza e a quantidade para conduzir experiências subsequentes. Este protocolo descreve um método eficiente para isolar ratinho adulto células endoteliais coronárias. O coração do rato é dissecado e picada em pedaços pequenos. Após a digestão do coração utilizando colagenase e dispase II, as células são lavadas e incubadas com esferas magnéticas que são conjugados com o anticorpo anti-CD31. As contas com células endoteliais são lavadas várias vezes e está pronto para usar em várias aplicações, incluindo imagens e experime biológica molecularNTS. Isolamento eficiente rende aproximadamente 10 4 células por um coração com mais de 90% de pureza.
Introdução
modelos de ratinho de várias doenças cardiovasculares e desordens metabólicas suportar mudanças fisiológicas e moleculares que são semelhantes aos encontrados em pacientes. Além disso, a alteração genética de ratinhos é uma ferramenta poderosa que nos permite investigar o papel patogénico de genes específicos no desenvolvimento e progressão de doenças. Hoje em dia, o gene-knock-in específico de células-tipo ou ratinhos -out podem ser facilmente gerados em muitos laboratórios e a medição de ARNm e os níveis de proteína em tipos específicos de células é o primeiro passo para determinar se os ratos foram verdadeiramente geneticamente modificado.
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Protocolo
A pesquisa em ratos foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Arizona e foi realizada de acordo com o Instituto Nacional de Saúde (NIH) orientações.
NOTA: Seções 1, 2 e 3 devem ser realizadas um dia antes do experimento, como a instalação.
1. Soluções Preparando
- tampão de CD31 (50 ml)
- Adicionar 50 ml de 1 x tampão fosfato salino (PBS) a um tubo de 50 ml. Pesar 0,05 g de Albumina de Soro Bovino (BSA) e 0,037 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e adicionar ao tubo de 50 ml e colocar o tubo para rodar durante cerca de 1 hora até dissolver o pó. Ajustar o pH para 7,4, filtrar atrav....
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Resultados
O isolamento de células endoteliais coronárias de um coração de rato normalmente produz cerca de 10 4 células com mais de 90% de pureza com uma forma de paralelepípedos. Para uma população pura de células endoteliais, o cuidado deve ser tomado ao longo do protocolo para garantir um ambiente estéril livre de qualquer contaminação. O aparecimento de células alongadas ou células alargada dentro da população indica contaminação com outros tipos de células, as células do músculo li.......
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Discussão
As células endoteliais mais utilizados na pesquisa são células humanas endoteliais da veia umbilical (HUVECs) por causa de sua conveniência e facilidade de cultivo. No entanto, uma grande quantidade de pesquisa requer a disponibilidade de um modelo fisiológico atingido pelo isolamento de células endoteliais específicas de outros órgãos 10. As células endoteliais formam uma população muito reduzida das células no tecido do coração; seu isolamento e cultura pode revelar-se muito difícil.
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela concessão do National Institutes of Health (HL115578 para A. Makino).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Bicarbonato de Sódio | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glicose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Anticorpo anti-rato CD31 para ratos | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Protease Neutra) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Colagenase Tipo II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glicerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Inibidor de fosfatase coquetel | Sigma | P0044-1ml | |
| Coquetel inibidor de protease | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparina | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valina | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
Referências
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al.
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Reimpressões e permissões
