Isolatie van muis coronaire endotheelcellen
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
Endotheelcellen lijn de binnenwand van bloedvaten en spelen een belangrijke rol bij de regulatie van de vasculaire tonus, vasculaire permeabiliteit en nieuwe vasculaire vorming. Endotheelcellen dysfunctie is betrokken bij de ontwikkeling en progressie van vele cardiovasculaire aandoeningen waaronder ischemische hartziekte. De functie en karakterisering van coronaire endotheelcellen onderzocht celisolatie is de eerste stap en vereist hoge zuiverheid en hoeveelheid en daaropvolgende experimenten. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om volwassen muizen coronaire endotheliale cellen te isoleren. De muis hart wordt ontleed en gehakt in kleine stukjes. Na de digestie van het hart met behulp dispase en collagenase II worden de cellen gewassen en geïncubeerd met magnetische kralen die geconjugeerd met anti-CD31 antilichaam. De korrels met endotheelcellen zijn gewassen meerdere malen en zijn klaar voor gebruik in diverse toepassingen, zoals beeldvorming en moleculaire biologische experimegen. Efficiënte isolatie levert ongeveer 10 4 cellen per één van hart met meer dan 90% zuiverheid.
Introduction
Muismodellen van diverse cardiovasculaire aandoeningen en metabolische aandoeningen dragen fysiologische en moleculaire veranderingen die lijken op die van patiënten. Bovendien, genetische verandering van muizen is een krachtig instrument dat ons toelaat om de pathogene rol van specifieke genen in de ontwikkeling en progressie van ziekten te onderzoeken. Tegenwoordig celtype-specifiek gen-knock-in muizen of uitchecken worden gemakkelijk opgewekt in veel laboratoria en de meting van mRNA en eiwitniveaus in specifieke celtypen is de eerste stap bij het bepalen of de muizen werden werkelijk genetisch gemodificeerd.
Endotheel is een enkele laag endotheelcellen (EC) waarmee de binnenkant vaatwand. Endotheliale cellen spelen een cruciale rol in het reguleren van de vasculaire spanning, vasculaire permeabiliteit en nieuwe vasculaire vorming van 1,2. Endotheliale disfunctie is een kenmerk van vele pathologische aandoeningen en veranderingen in endotheelfunctie kan leiden tot verschillende autocardiovasculaire ziekten 3,4. Het is dus belangrijk om de functie van endotheliale cellen te bestuderen onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.
Er zijn verschillende manieren om EC 5-8 uitschakelen en de isolatiewerkwijze moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de weefsels en soorten worden gebruikt. Dit komt omdat EC uit verschillende weefsels een hoge mate van heterogeniteit tonen met betrekking tot hun oppervlaktemarkers en eiwitexpressie 9. Succesvolle isolatie van endotheelcellen kan vaak lastig zijn en vereist een zekere mate van opleiding en praktijk. Eenmaal bereikt, de werkwijze in dit protocol voorgesteld isolatie blijkt stabiel en efficiënt.
Het algemene doel van deze methode is om het verkrijgen van de muis coronaire EC (MCECs) van hoge kwaliteit en kwantiteit. Hoewel de hoeveelheid cellen verzameld uit een hart minder dan cellen verzameld uit andere weefsels met behulp van andere technieken, deze techniek nog betkwaliteit ter. De zuiverheid van endotheelcellen in de resulterende populatie groter dan 90%. Zo zou deze techniek ideaal voor toepassingen die afhankelijk zijn van louter geïsoleerde endotheelcellen zoals cell imaging zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest gebruikte endotheelcellen onderzoek humane navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC's) vanwege hun gemak en kweken. Echter, veel onderzoek nodig is dat een fysiologisch model verkregen door isolatie van endotheelcellen uit andere specifieke organen 10. Endotheelcellen vormen een zeer kleine populatie van cellen in het hartweefsel; hun isolement en het kweken kan blijken te zijn zeer moeilijk te zijn.
Er zijn drie cruciale stappen in dit protocol. De eerste is om het…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de subsidie van de National Institutes of Health (HL115578 A. Makino).
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
Referências
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
