Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Summary

Este protocolo está preparado para compartilhar nosso método de isolamento de células endoteliais coronárias de camundongos para fins de imagem ou para conduzir experimentos biológicos moleculares.

Abstract

As células endoteliais estão alinhados na parede interna dos vasos sanguíneos e desempenham um papel importante na regulação do tónus vascular, da permeabilidade vascular, e nova formação vascular. disfunção das células endoteliais está implicada no desenvolvimento e progressão de muitas doenças cardiovasculares, incluindo doença cardíaca isquémica. Para examinar a função e caracterização de células endoteliais coronárias, o isolamento de células é o primeiro passo e exige elevado grau de pureza e a quantidade para conduzir experiências subsequentes. Este protocolo descreve um método eficiente para isolar ratinho adulto células endoteliais coronárias. O coração do rato é dissecado e picada em pedaços pequenos. Após a digestão do coração utilizando colagenase e dispase II, as células são lavadas e incubadas com esferas magnéticas que são conjugados com o anticorpo anti-CD31. As contas com células endoteliais são lavadas várias vezes e está pronto para usar em várias aplicações, incluindo imagens e experime biológica molecularNTS. Isolamento eficiente rende aproximadamente 10 ⁴ células por um coração com mais de 90% de pureza.

Introduction

modelos de ratinho de várias doenças cardiovasculares e desordens metabólicas suportar mudanças fisiológicas e moleculares que são semelhantes aos encontrados em pacientes. Além disso, a alteração genética de ratinhos é uma ferramenta poderosa que nos permite investigar o papel patogénico de genes específicos no desenvolvimento e progressão de doenças. Hoje em dia, o gene-knock-in específico de células-tipo ou ratinhos -out podem ser facilmente gerados em muitos laboratórios e a medição de ARNm e os níveis de proteína em tipos específicos de células é o primeiro passo para determinar se os ratos foram verdadeiramente geneticamente modificado.

Protocol

A pesquisa em ratos foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Arizona e foi realizada de acordo com o Instituto Nacional de Saúde (NIH) orientações.

NOTA: Seções 1, 2 e 3 devem ser realizadas um dia antes do experimento, como a instalação.

1. Soluções Preparando

1. tampão de CD31 (50 ml)
   1. Adicionar 50 ml de 1 x tampão fosfato salino (PBS) a um tubo de 50 ml. Pesar 0,05 g de Albumina de Soro Bovino (BSA) e 0,037 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e adicionar ao tubo de 50 ml e colocar o tubo para rodar durante cerca de 1 hora até dissolver o pó. Ajustar o pH para 7,4, filtrar atrav....

Results

O isolamento de células endoteliais coronárias de um coração de rato normalmente produz cerca de 10 ⁴ células com mais de 90% de pureza com uma forma de paralelepípedos. Para uma população pura de células endoteliais, o cuidado deve ser tomado ao longo do protocolo para garantir um ambiente estéril livre de qualquer contaminação. O aparecimento de células alongadas ou células alargada dentro da população indica contaminação com outros tipos de células, as células do músculo li.......

Discussion

As células endoteliais mais utilizados na pesquisa são células humanas endoteliais da veia umbilical (HUVECs) por causa de sua conveniência e facilidade de cultivo. No entanto, uma grande quantidade de pesquisa requer a disponibilidade de um modelo fisiológico atingido pelo isolamento de células endoteliais específicas de outros órgãos ^10. As células endoteliais formam uma população muito reduzida das células no tecido do coração; seu isolamento e cultura pode revelar-se muito difícil.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Sigma	A3311-10G
EDTA	Fisher	BP120-500
HBSS	Fisher	SH3026801
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Bicarbonato de Sódio	Sigma	S5761
D-(+)-Glicose	Sigma	G7021-1KG
DynaBeads pan mouse IgG beads	Thermo Fisher Scientific	11035
Anticorpo anti-rato CD31 para ratos	BD Biosciences	550274
IFCS	Fisher	SH30072.04
M199	Fisher	MT10060-CV
Dispase (Protease Neutra)	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS02109
Colagenase Tipo II	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS004176
Glicerol	Fisher	BP381-1
Igepal	Sigma	I3021-50 ml
Inibidor de fosfatase coquetel	Sigma	P0044-1ml
Coquetel inibidor de protease	Sigma	P8340-1 ml
Heparina	Sigma	H3149-100KU
FBS	Fisher/Mediatech	MT35010CV
D-Valina	Sigma	V1255-5G
EGS	Corning	356006
Penicilina/Estreptomicina	Fisher/Mediatech	MT-30-002-CI