İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
Kültürlenmiş kardiyomiyositlerde vivo sistemler tamamlayıcı olan teknikler kullanılarak kardiyomiyosit biyolojisi okumak için kullanılabilir. Örneğin, in vitro kültür saflığı ve erişilebilirlik biyokimyasal analizler, canlı görüntüleme ve elektrofizyoloji üzerinde hassas kontrol sağlar. kardiyomiyositlerinin uzun süreli kültür kısa vadeli kültürlerde tamamlanamaz ek deneysel yaklaşımlara erişim imkanı sunmaktadır. Örneğin, dediferansiyasyon hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesinin in vitro soruşturma şimdiye kadar büyük ölçüde uzun vadeli kültüründe daha sağlam gibi görünen sıçan kardiyomiyositlerde, sınırlı olmuştur. Ancak, transgenik fare hatları ve iyi gelişmiş hastalık modellerinde zengin bir araç seti durumu kalp araştırma için fare sistemleri cazip kılmaktadır. çeşitli raporlar yetişkin fare kardiyomiyosit izolasyon bulunmasına rağmen, az sayıda çalışma uzun vadeli kültürünü göstermektedir. Burada yer alan, bir adım adım bir yöntemdiryetişkin fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve uzun süreli kültür. İlk olarak, retrograd Langendorff perfüzyonu etkin gravite sedimantasyon, ardından arıtma için proteazlarla kalp sindirimi için kullanılır. farksızlaşma Aşağıdaki izolasyon bir süre sonra, hücreler giderek kültür tutunur ve hafta içinde kültürlenebilir. Adenovirüs, hücre lisatı etkin izole kardiyomiyositlerde transduse etmek için kullanılır. Bu yöntemler kalp biyoloji okumak için basit, ama güçlü bir model sistemi sağlar.
Introduction
Kültürlü kardiyomiyositlerde sıklıkla in vitro iyi kontrollü bir ortamda hücre davranışlarını izlemek için kullanılır. Örneğin, morfolojik, elektrik, biyokimyasal veya mekanik hücre özellikleri, oluşturulmuş ortam içinde 1,2 ve küçük moleküllü ilaçlar, peptid, gen düzenlenmesi, 3 ya da elektriksel uyarıya tepki olarak tasarlanmış substratlar üzerinde incelenebilir. 4, hücresel içeriği olabilir Ayrıca, tanımlanan eş-kültür ile kontrol edilebilir. 5 Bu in vitro deneyler, büyük ilaç ya da genetik ekranlar yararlıdır ve kardiyomiyosit biyoloji içeren araştırmalar çeşitli in vivo yöntemlerinde tamamlar.
Uzun süreli kültür fenotipik değişim elde etmek için zaman uzun zaman gerektirebilir deneysel yollar sağlar. Zamanında bir örnek olduğunu dediferansiyasyon hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesi genellikle üzerinde çalışılan se Erişkin memeli kardiyomiyosit çoğalması, biridirhaftaya veral gün. Burada 6,7, uzun kültür süresi, genetik manipülasyon, 7,8 işlevsel farklılaşma bozukluğunun (örneğin, sarkomerik demontaj) 9 ve potansiyel transkripsiyon dediferansiyonunu kolaylaştırır. 6 sonraki hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesi daha uzun kültür dönemleri gerektirmektedir bölünme birden mermi deneysel hedef, özellikle gözlemlemek. Kardiyomiyosit hücre döngüsünün önemi önceden mevcut kardiyomiyositlerinin farksızlaşma ve çoğalması zebrabalıkları ve neonatal farelerde kalp rejenerasyon sorumlu gösterilmiştir kalp rejenerasyon, birkaç yeni anahtar bilimsel çalışmalar için merkezi. 10-12 Böylece, olasılık memeli yetişkin kardiyomiyositlerde farksızlaşma ve hücre döngüsü yeniden giriş uyarmak için insan kalbi rejenerasyon 13-15 anahtar soruyu kalır
Ben n memeli kardiyo hücre döngüsünü okuyan in vitro deneylermiyositler ağırlıklı nedeni fare modelleri ile karşılaştırıldığında uzun dönem kültür göreceli kolaylığı, sıçan kaynakları kullanılmıştır. 16 Bununla birlikte, faregiller sistemlerinin her ikisi de, in vitro ve in vivo olarak yararlı olan, iyi karakterize transjenik araçları ve hastalık modellerinde zengin bir kaynak sunar protokoller. Örneğin, Cre tabanlı soy izleme in vivo yenidoğan fare kalbinde miyokard rejenere kaynağı olarak önceden varolan kardiyomiyositlerinin belirlenmesini sağladı. Soy-takip yenidoğan fare kardiyomiyositlerde 12 In vitro çalışmalar stromal ile etkileşimlerin inceleme sağlamıştır fibroblastlar ile ko-kültür yoluyla hücreler. 5 Ancak, onun zorluklar nedeniyle, 17 birkaç rapor yetişkin fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve uzun vadeli kültürü var. 18,19
yalnız kısa süreli kültür için geçerli yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu zor bir görev olduğu bilinmektedir. Bu protocol kısa vadeli hem de uzun vadeli soruşturma hem de kullanılabilir yetişkin farelerin canlı kardiyomiyositlerde ulaşmak için nasıl adım adım yönergeler sağlar. Bu protokolü kullanılarak izole kardiyomiyositlerde verimli adenoviral vektörlerin hafta boyunca 20,21 ve kültürlü kalıt edilebilir. Bu yöntemler, in vitro kardiyomiyosit biyolojisi okumak için güçlü sistem sağlar.
Burada tarif edilen yöntemler Langendorff retrograd perfüzyon varyasyonları kullanarak önceki eserlerinden çeşitli unsurları dayanmaktadır. 18,22 birkaç protokoller kısa süreli kültür ve çalışma, 23-25 avantajı için yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu yayınlanan olmasına rağmen Bu protokol kültürüne yeteneği izole kardiyomiyositlerde uzun vadeli olduğunu. Bu ektopik gen ekspresyonunu içeren ve hücre yeniden programlama stratejileri gibi uzun süreler gerektiren hücresel süreçlerin çalışmasında yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İzole kardiyomiyositlerinin genel sağlık Bu protokolün birkaç önemli yönlerini bağlıdır. İlk olarak, perfüzyon kalp çıkartılmasından süresi önemli ve 5 dakika veya daha kısa sürede yapılmalıdır. Kalsiyum çıkarılması hücre-hücre etkileşimleri ayırmak yardımcı olur, ancak negatif hücre sağlığı uzun vadeli etkileyebilir. 29-32 Böylece, bu yeterli EGTA tarafından perfüzyon ilk birkaç dakika boyunca kalsiyum kaldırmak için (etilen glikol tetraasetik asit) şelasyon bulma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje (Sandler Vakfı tarafından kısmen finanse edilen) Atılım Biyomedikal Araştırma UCSF Programı, Bağımsızlık Ödülü NIH Pathway (R00HL114738) ve Edward Mallinckrodt Jr Vakfı tarafından finanse edildi. JJ NIH (T32HL007731) bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir. Yazarlar mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir, bu işin, içeriklerinden sorumludur.
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
Referências
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
