Ontwikkeling en karakterisering van<em> In Vitro</em> Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup> 2+</sup>]<sub> i</sub> En productie van stikstofoxide
Summary
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.
Abstract
Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC's worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype. Hoewel de ontwikkeling van microfluïdische apparaten is omarmd door ingenieurs meer dan twee decennia, hun biologische toepassingen blijven beperkt. Een fysiologisch relevant in vitro model microvaatje bevestigd met biologische toepassingen is het belangrijk om het veld bevorderen en overbruggen van de kloof tussen in vivo pt in vitro onderzoeken. Hier presenteren we gedetailleerde procedures voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk via een microfluïdische inrichting met een lange-termijn perfusie vermogen. We tonen ook aan haar verzoeken om kwantitatieve metingen van-agonist geïnduceerde veranderingen in EG [Ca 2+] i en stikstofmonoxide (NO) productie in real-time met behulp van confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De gevormde microvaatje nettowerken met continue perfusie toonde goed ontwikkelde verbindingen tussen EC. VE-cadherine distributie was dichter bij die waargenomen in intacte microvaatjes dan statisch gekweekte EC monolagen. ATP-geïnduceerde tijdelijke toename van EG [Ca2 +] i en NO productie werden kwantitatief gemeten op individueel celniveau, die de functionaliteit van de gekweekte microvaatjes gevalideerd. Deze microfluïdische apparaat kan ECs te groeien onder goed gecontroleerde, fysiologisch relevante stroom, waarbij de celkweek omgeving dichter bij in vivo dan die in de conventionele, statische 2D culturen maakt. Het microkanaal netwerk ontwerp is zeer veelzijdig, en het fabricageproces is eenvoudig en herhaalbaar. Het apparaat kan eenvoudig worden geïntegreerd in de confocale microscopische of conventionele systeem voor hoge resolutie beeldvorming. Belangrijker, omdat de gekweekte microvaatje netwerk kan worden gevormd door primaire humane EC, zal deze benadering een nuttig instrument om te onderzoeken hoepathologisch veranderde bloedcomponenten van patiënt monsters hebben voor de EC en geven inzicht in de klinische problemen. Het kan ook worden ontwikkeld als een platform voor drug discovery.
Introduction
Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC's worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype 1,2. De microfluidics technologie maakt een nauwkeurig gecontroleerde vloeistof door een geometrisch beperkt microschaal (sub-millimeter) kanalen 3, dat de mogelijkheid voor gekweekte cellen voorziet, met name voor vasculaire EC, om te groeien onder de gewenste stroom omstandigheden. Deze eigenschappen maken de celkweekomstandigheden dichter bij in vivo dan de conventionele, statische 2D celkweken. Ze zijn zeer belangrijk bij de microfluïdische apparaten worden gebruikt om verschillende soorten vasculatures modelleren en EG reacties op mechanische en / of chemische prikkels bestuderen.
Ondanks de voordelen aangetoond door de microkanaal-netwerk via een statisch celkweek, de aanpassing en de toepassing van microfluidics in de biomedische field blijven beperkt. Gemeld door een recent overzicht, het merendeel van de publicaties van dit gebied (85%) zijn nog in engineering journals 4. De prestaties van microfluïdische apparaten is niet overtuigend genoeg voor de meeste biologen over te stappen van de huidige technieken, zoals de Transwell test en de macro-schaal cultuur schotel / glasplaatje om dit geminiaturiseerde apparaat. Microfluidics is een multidisciplinair veld, dat interdisciplinaire samenwerking vereist dat dit gebied vooruitgang te boeken. Het doel van dit technische artikel is om de lacunes in de kennis te verminderen tussen disciplines en maken de fabricage procedures begrijpelijk door biologen, terwijl het verstrekken van biologische toepassingen en functionele validatie van de microfluïdische microvaatjes. De gevisualiseerde experimentele protocollen omvatten fabricage van zowel microfluïdische apparaten en hun biologische nutsbedrijven, die een nauwe samenwerking tussen ingenieurs en biologen vertegenwoordigt.
We hebben onlangs melding gemaakt van enkelebiologische toepassingen die de in vitro microvaatje netwerk microfluïdische apparaat 5. Om op passende ontwerp van de afmetingen van het microkanaal netwerk en breng de gewenste schuifspanning werd een numeriek model gebouwd met numerieke stromingsleer software om het stromingsprofiel nauwkeurig schatten. Primaire humane navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC) die werden gezaaid in de microkanalen confluentie bereikten, dat wil zeggen onder de volledige binnenoppervlakken van het microkanaal, 3-4 dagen continue perfusie. De barrièrevorming juiste bleek uit VE-cadherine kleuring en vergeleken met die gevormd in statische celkweekomstandigheden en in intacte microvaatjes. Door toepassing van de experimentele protocollen ontwikkeld individueel intacte geperfundeerde microvaatjes 6-8, we kwantitatief gemeten veranderingen in EG [Ca2 +] i en stikstofoxide (NO) in reactie op adenosine trifosfaat (ATP) met fluorescerende indicators en confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De door agonist geïnduceerde toenamen in EG [Ca2 +] i en NO productie gemeld noodzakelijk intracellulaire signalen voor inflammatoire mediator-geïnduceerde toenames in permeabiliteit microvaatjes 6-15. Hoewel sommige eerdere studies beelden van DAF-2 DA beladen microfluïdische apparaten 16,17 toonde, had juiste resolutie en data-analyse nog niet bereikt 18. Voor zover wij weten, deze studie toont de eerste kwantitatieve metingen van door agonist veroorzaakte dynamische verandering in endotheelcellen [Ca2 +] i en NO opstelling met microfluïdische systeem.
Microproductietechnieken de flexibiliteit om microkanalen fabriceren tot een paar micrometer en maken de ontwikkeling mogelijk van complexe patronen op de geometrie van in vivo microvasculatuur nabootsen. Hier presenteerden we een typische microkanaal netwerk met drie niveaus van vertakking. Dezenetwerk wordt vervaardigd door de combinatie van fotolithografie die wordt uitgevoerd in een cleanroom microfabrication en zachte lithografie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk, de karakterisering van EG kruispunten en F-actine cytoskelet distributie en de kwantitatieve metingen van EG [Ca2 +] i en NO-productie met behulp van een microfluïdische apparaat. Geperfundeerde microfluïdische apparaat verschaft een in vitro model dat een getrouwe simulatie van de in vivo microvasculaire geometrieën afschuiving stroomomstandigheden toelaat. Si…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute verleent HL56237, National Institute of Diabetes en spijsvertering en Kidney Diseases Institute DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 en EPS-1003907).
Materials
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCL (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose(5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
Referências
- Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
- Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
- He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
- Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
- Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
- Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
- He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
- He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
- Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
- Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
- D’Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
- Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
- Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
- Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
- Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
- McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
- Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).
- Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
- Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).
