Gelişim ve karakterizasyonu<em> İn Vitro</em> Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup> 2+</sup>]<sub> I</sub> Ve Nitrik Oksit Üretimi
Summary
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.
Abstract
In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip sergiler. mikroakışkan cihazların geliştirilmesi iki yılda mühendis tarafından benimsemiş olmasına rağmen, onların biyolojik uygulamalar sınırlı kalır. Biyolojik uygulamalar tarafından onaylanmış bir daha fizyolojik ilgili in vitro mikrovasküler modeli alanını ilerletmek ve in vivo ve in vitro çalışmalar arasında boşlukları doldurmak için önemlidir. Burada, uzun vadeli bir perfüzyon yeteneğine sahip bir mikroakışkan cihaz kullanarak kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı prosedürler mevcut. Ayrıca konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak AT [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) üretiminin, agonist ile uyarılan değişiklikleri nicelik uygulamaları göstermektedir. oluşan mikrovasküler netSürekli perfüzyon ile iş EC arasında iyi gelişmiş kavşaklar gösterdi. dağıtım-cadherin VE statik kültürlü AK mono tabakaları daha sağlam mikrodamarlar gözlenen yakın oldu. EC geçici bir artış ATP'ye bağlı [Ca2 +] i ve NO üretimi kantitatif kültürlenmiş mikro damarların özelliğe geçerli bir hücre seviyeleri ölçülmüştür. Bu mikroakışkan cihaz EC, geleneksel statik 2B kültürlerinde daha vivo hücre kültürü ortamı daha yakın hale getirir, iyi kontrol edilen, fizyolojik olarak uygun akış altında büyümesine izin verir. Mikrokanal ağ tasarımı çok yönlü ve üretim süreci basit ve tekrarlanabilir. Cihaz kolayca yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan konfokal ya da geleneksel mikroskopik sisteme entegre edilebilir. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından oluşturulan çünkü En önemlisi, bu yaklaşım nasıl araştırmak için yararlı bir araç olarak hizmet verecekpatolojik hasta örneklerinden değişmiş kan bileşenleri insan ECS etkileyen ve klinik konularda bilgi sağlar. Aynı zamanda ilaç taraması için bir platform olarak geliştirilebilir.
Introduction
In vivo olarak, kan damarı duvarlarını oluşturan endothelial hücreleri (EC), sürekli akıma maruz kalması ama kültür EC, genellikle statik koşullar altında yetiştirilen ve pro-enflamatuar bir fenotip 1,2 sergilemektedir. Mikroakiskan teknolojisi, istenen akış koşulları altında büyümek, özellikle damar EC'ler için, kültürlenmiş hücreler için bir fırsat sağlar geometrik kısıtlı mikro (alt milimetre) kanallar 3 ile hassas bir şekilde kontrol sıvısı sağlar. Bu özellikler, geleneksel statik 2B hücre kültürlerinde daha etkin in vivo hücre kültürü koşulları daha yakın hale. Onlar mikroakışkan cihazlar vaskülatürlerden farklı modellemek için kullanılır ve mekanik ve / veya kimyasal uyarılara AT yanıtları incelemek için zaman son derece önemlidir.
statik hücre kültürü, biyomedikal f adaptasyon ve Mikroakiskan uygulama üzerinde mikro ağı gösterdiği avantajlara rağmenield sınırlı kalır. Son gözden tarafından bildirilen bu alanda (% 85) yayınların çoğunluğu mühendislik dergilerinde 4 hala. mikroakışkan cihazların performansı çoğu biyolog gibi Transwell tahlil ve bu minyatürize cihaza makro ölçekli kültür çanak / cam slayt olarak mevcut tekniklerle geçiş için yeterli inandırıcı olmamıştır. Mikroakiskan ileriye bu alanı taşımak için disiplinler arası işbirliklerini gerektiren multidisipliner bir alandır. Bu teknik makalenin amacı, biyolojik uygulama ve mikroakışkan mikrodamarlar işlevsel doğrulama sağlarken, disiplinler arasındaki bilgi farkının azaltılması ve biyologlar tarafından fabrikasyon prosedürleri anlaşılır hale getirmektir. görüntülenmiştir deneysel protokoller mikroakışkan cihazlar ve mühendis ve biyolog arasında yakın bir işbirliğini temsil biyolojik yarar, hem de imalat içerir.
Biz son zamanlarda bazı bildirildiMikroakışkan cihaz 5 ile in vitro mikrovasküler ağını kullanarak biyolojik uygulamalar. uygun istenilen kayma gerilmesini mikrokanal ağı boyutlarını tasarım ve uygulamak için, bir sayısal model yakından akış profili tahmin etmek bilgisayarlı akışkan dinamik yazılımı ile inşa edilmiştir. Örneğin, bir araya gelerek konfluens mikro serpildi Primer insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), sürekli perfüzyonla 3-4 gün içinde, mikrokanalın tüm iç yüzeylere sahiptir. Uygun bir bariyer oluşturulması, statik hücre kültürü koşulları altında ve bozulmamış mikrodamarlar oluşan kıyasla VE-cadherin boyamasıyla gösterilmiştir ve daha. Bireysel perfüze sağlam mikrodamarlar 6-8 geliştirilen deneysel protokolleri uygulayarak, kantitatif EC değişiklikleri ölçülen [Ca2 +] i ve nitrik oksit (NO) floresan içinde olan adenozin trifosfat (ATP) cevaben üretimigöstergeleri ve konfokal ve konvansiyonel floresan mikroskobu. EC agonist kaynaklı artışlar [Ca2 +] i ve NO üretimi mikrodamar geçirgenliği 6-15 inflamatuar medyatör ile endüklenmiş artışından kaynaklandığını için gerekli olan hücre içi sinyaller olarak bildirilmiştir. Önceki bazı çalışmalarda DAF-2 DA yüklü mikroakışkan cihazlar 16,17 görüntülerini gösterdi rağmen, uygun çözünürlük ve veri analizi henüz 18 elde etmemişti. Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışma endotelyal agonist kaynaklı dinamik değişim [Ca2 +] i ve NO üretimi kullanan mikroakışkan tabanlı sistem ilk nicel ölçümlerini göstermektedir.
Imalat teknikleri birkaç mikron mikrokanallar aşağı imal ve in vivo mikrovasküler geometrileri taklit etmek karmaşık desenleri gelişmesini sağlamak için esnekliğe sahip. Burada dallanma üç seviyeleri ile tipik bir mikrokanal ağı sundu. Buağ mikroimalat temiz oda ve yumuşak litografi gerçekleştirilir fotolitografi kombinasyonu ile imal edilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, kültürlü mikrovasküler ağının geliştirilmesi için ayrıntılı protokoller mevcut, AK kavşak ve F-aktin dağıtım hücre iskeleti karakterizasyonu ve AT'nin kantitatif ölçümler [Ca2 +] i ve bir mikroakışkan cihaz kullanarak NO üretimi. Perfüze mikroakışkan cihaz in vivo mikrovasküler geometri ve kayma akış koşulları yakın simülasyon sağlayan bir in vitro model sağlar. kültürlü mikrovasküler ağ birincil insan EC tarafından ol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından desteklenen HL56237, Diyabet, Sindirim Ulusal Enstitüsü ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü DK97391-03, Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1227359 ve EPS-1003907) verir.
Materials
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCL (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose(5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
Referências
- Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
- Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
- He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
- Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
- Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
- Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
- He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
- He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
- Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
- Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
- D’Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
- Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
- Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
- Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
- Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
- McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
- Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).
- Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
- Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).
