In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier
Summary
In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.
Abstract
Stam en stamcellen uit volwassen pancreas zou een potentiële bron van therapeutische beta-achtige cellen voor de behandeling van patiënten met type 1 diabetes. Het is echter nog onbekend of stamcellen en voorlopercellen bestaan in de volwassen pancreas. Onderzoekstrategieën gebruik cre-lox-lineage tracing bij volwassen muizen resultaten die hetzij bevestigd of weerlegd het idee dat beta-cellen kunnen worden gegenereerd uit de leidingen, de vermoedelijke plaats waar volwassen pancreas voorlopercellen mogen verblijven opgeleverd. Deze in vivo cre-lox-lineage tracing, echter niet de vragen van zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie twee criteria die voor een stamcel definiëren beantwoorden. Om te beginnen met het aanpakken van deze technische kloof, we bedacht 3-dimensionale kolonie assays voor alvleesklier voorlopers. Kort na onze eerste publicatie, andere laboratoria onafhankelijk ontwikkelde een vergelijkbaar, maar niet identiek, methode genaamd de organoïde test. Vergeleken met de organoïde assay onze werkwijze pastmethylcellulose, waarin viskeuze oplossingen die de opname van extracellulaire matrixeiwitten bij lage concentraties mogelijk maakt. De methylcellulose-bevattende assays kan vergemakkelijken detectie en analyse van progenitorcellen bij de enkele-celniveau, die kritisch zijn als voorlopers kleine subpopulatie vormen, zoals het geval is voor vele organen volwassen stamcellen. Samen resultaten van verschillende laboratoria aan in vitro zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie van pancreatische voorlopercellen-achtige cellen van muizen. De huidige protocollen beschrijven twee-methylcellulose gebaseerde kolonie assays om de muis alvleesklier voorlopercellen te karakteriseren; één bevat een commercieel preparaat van muizen extracellulaire matrixeiwitten en de andere een kunstmatige extracellulaire matrix eiwit bekend als laminine hydrogel. De hier getoonde technieken zijn 1) dissociatie van de pancreas en sorteren van CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen van volwassen muizen, 2) enkele cel manipulatie van de sorted cellen, 3) enkele kolonie geanalyseerd met behulp van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, en 4) dissociatie van primaire kolonies in single-cell schorsingen en re-plating in secundaire kolonie assays om zelfvernieuwing of differentiatie te beoordelen.
Introduction
De alvleesklier bestaat uit drie grote cellijnen; acinar cellen scheiden spijsverteringsenzymen, leidingen afscheiden mucine af te weren ziektekiemen en spijsverteringsenzymen vervoeren naar de darmen, en endocriene cellen scheiden hormonen, waaronder insuline en glucagon, die glucose homeostase te handhaven. Tijdens de embryonale ontwikkeling van de pancreas, de vroege ductale cellen zijn de bron van de tri-potente stamcellen kan leiden tot de drie lijnen in de pancreata van volwassen dieren 1,2. Omdat volwassen stamcellen en progenitor cellen, zoals beenmerg stamcellen, reeds met succes gebruikt om verschillende ziekten te behandelen 3, is er grote interesse in het vinden van de stamcellen en voorlopercellen in de volwassen pancreas. Als isolatie en manipulatie van volwassen pancreas stamcellen en progenitorcellen mogelijk was, konden deze cellen worden gebruikt om ziekten zoals type 1 diabetes, waarbij de insuline uitscheidende cellen vernietigd door autoimmuniteit.
<p class = "jove_content"> Of tri-potente stamcellen bestaan nog steeds in volwassen pancreas kabelgoten na de voltooiing van de embryonale ontwikkeling is een vraag die zwaar wordt gedebatteerd in de wetenschappelijke gemeenschap. In dit debat, en het gebruik van in vivo cre-lox lineage-tracing technieken, Inada en collega's toonden aan dat volwassen muizen ductaal cellen gelabeld met een marker, koolzuuranhydrase II, aanleiding kan geven tot alle drie de alvleesklier lijnen 4 geven. Het gebruik van andere ductale merkers, zoals HNF1b 5 en SOX9 2, werd geconcludeerd dat ductale cellen niet de belangrijkste bron van beta-cellen in volwassen muizen.Enkele jaren geleden stelden we voor dat de oorzaak van de bovengenoemde discussie door gebrek kan, in het gebied 6,7 van passende analytische instrumenten die kunnen worden gebruikt voor zelf-vernieuwing en multi-lijn differentiatie twee criteria die voor meten definieert een stamcel. De in vivo cre-lox-lineage tracing techniek genoemdhierboven kan bewijs voor de voorlopercellen-nageslacht relatie op een bevolking niveau. Echter, deze lineage tracing techniek beperkt in haar vermogen om te onderscheiden of enkele stamcellen kunnen zichzelf vernieuwen en differentiëren in meerdere lijnen. Eencellige analyse is belangrijk omdat wanneer verschillende mono-potente stamcellen elk met een verschillende afkomst potentieel, samen geanalyseerd, kunnen gezamenlijk lijken ze multi-lijn differentiatie capaciteiten. Bovendien stamcellen zijn meestal een kleine populatie van volwassen organen. De activiteiten van een kleine celpopulatie kan worden gemaskeerd door de grote bevolkingscentra. Daarom is een negatief resultaat van een studie populatie niet noodzakelijkerwijs de afwezigheid van stamcellen. Tenslotte wordt cre-lox lineage tracing niet toelaten dat de meting van zelfvernieuwing.
Beginnen aanpakken van de technische gat in het gebied van pancreatische voorlopercellen celbiologie, kolonie 7-11 of 12-15 organoïde </sup> assays met behulp van 3D kweeksystemen werden bedacht. Twee Testen van kolonies van pancreatische voorlopers ontwikkeld in ons laboratorium: één bevat een commercieel preparaat van muizen extracellulaire matrix (ECM) (zie werkwijzen pt apparatuur Table), en de andere bevat laminine hydrogel, een gedefinieerde kunstmatige ECM eiwitten 7-11. Voorlopercellen worden gemengd in semi-vast medium dat methylcellulose. Methylcellulose is een biologisch inert en viskeus materiaal bereid uit houtvezels en werd routinematig gebruikt in hematopoietische Testen van kolonies 16. De methylcellulose bevattende halfvast medium beperkt de beweging van één progenitorcellen zodat ze niet opnieuw aggregaat. Toch is het medium is zacht genoeg om een voorlopercel te groeien en differentiëren in een kolonie van cellen in de 3D-ruimte. Volgens de traditie van de hematologen, een pancreas voorlopercellen cellen die in staat zijn die aanleiding geven tot een kolonie van cellen was, was named een pancreas-kiemgetal (PCFU). PCFUs, wanneer ze groeien in het muizen-bevattende ECM kolonie assay, aanleiding geven tot cystic kolonies die de naam "Ring" kolonies 7. Na toevoeging van een Wnt-agonist, R-spondin1, in het muizen-ECM met cultuur, sommige Ring kolonies te zetten in 'Dense "kolonies 7. In dit artikel worden deze twee soorten kolonies gegroeid in muizen ECM cultuur gezamenlijk aangeduid als "Ring / Dense" kolonies. Wanneer Ring / Dense kolonies kunnen worden gescheiden in enkele celsuspensie en opnieuw uitgeplaat in culturen die laminine hydrogel bevatten, "Endocrine / Acinaire" kolonies gevormd 7.
Met behulp van een kolonie analyses bleek dat de meeste Ring / Dense en endocriene / Acinaire kolonies, hetzij uit volwassen (2-4 maanden oud) 7,11 of jong (1 week oud) 9 muizen pancreas, druk alledrie lineage markers. Dit suggereert dat de meeste PCFUs oorsprong zijn tri-potente. In het muizen-bevattende ECM kolonie assay, volwassen muizen PCFUs robuust zichzelf te vernieuwen en uit te breiden ongeveer 500.000 keer meer dan 11 weken in de cultuur 7. Murine ECM ondersteunt bij voorkeur de differentiatie van ductale cellen over endocriene en acinaire lineages, terwijl in de aanwezigheid van laminine hydrogel, murine PCFUs aangemoedigd om bij voorkeur differentiëren tot endocriene en acinaire cellen en in mindere mate aan de ductale lijn 7,9,11. Belangrijk is Insuline + Glucagon – mono-hormonale cellen worden gegenereerd in de laminine hydrogel cultuur en uitscheiden van insuline in reactie op stimulatie glucose in vitro 7,9, wat suggereert functionele volwassenheid. De tri-lineage differentiatie potentieel 7,9 en zelf-vernieuwing 11 van de individuele PCFUs worden bevestigd door eencellige Micromanipulatie, dat wil zeggen, het kweken van een cel per putje voor de vorming van kolonies. Samen vormen deze resultaten tonen dat er een zelf-vernieuwing, tri-potent, voorlopercellen-achtige cellen in de postnatale muizen alvleesklier die activiteiten in 3D cultuur te laten zien.
De muizen PCFU assays beschreven in dit artikel worden afgeleid van een kolonie assay ontwikkeld voor progenitorcellen opzichte van muriene embryonale stamcellen (mESCs) 17. Dat protocol is vastgelegd in detail beschreven in een ander Jupiter publicatie 18. De cultuur componenten en technieken die nodig zijn om de murine-bevattende ECM kolonieproefmedium voor volwassen PCFUs voeren zijn dezelfde als voor mES afkomstige voorlopers 17,18. Daarom zijn deze aspecten van de bepaling hier niet worden herhaald; in plaats daarvan de volgende procedures aan de orde: 1) dissociatie van de volwassen pancreas en sorteren CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen, die PCFUs verrijken van volwassen muizen 7, 2) eencellige manipulatie van de gesorteerde cellen, 3) single-kolonie analyseert het gebruik van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, en 4) dissociatie van colonies in single-cell schorsing en re-plating in muizen ECM of laminine hydrogel kolonie assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
De alvleesklier kolonie assays en enkele kolonie analyses die hier beschreven werden geïnspireerd door de methylcellulose-bevattend hematopoietische kolonie testen die belangrijke rollen in het ontcijferen van de biologie van hematopoietische stamcellen in de afgelopen decennia 23 hebben gespeeld. In deze assays (figuur 5), gescheiden pancreatische cellen uitgeplaat in methylcellulose bevattende halfvaste media met geschikte groeifactoren en ECM eiwitten die de vorming van Ring, Dense of end…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Lucy Brown en Alexander Spalla uit de Analytical Cytometry Core in het City of Hope voor hulp bij het sorteren. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01DK081587 en R01DK099734 om HTK en U01DK089533 ADR, en door de National Science Foundation subsidie NSF-DMR-1206121 en California Institute for Regenerative Medicine subsidie RB5-07398 naar DAT Supports uit de Joseph J. Jacobs Institute for Molecular engineering voor Geneeskunde bij Caltech naar dAT, en die van Oxnard Foundation en Ella Fitzgerald Stichting HTK zijn ook dankbaar erkend.
Financiering: Dit werk is gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01DK081587 en R01DK099734 om HTK en U01DK089533 ADR, en door de National Science Foundation subsidie NSF-DMR-1206121 en California Institute for Regenerative Medicine subsidie RB5-07398 aan DAT Ondersteunt uit de Joseph J. JacobsInstitute for Molecular Engineering voor Geneeskunde bij Caltech naar DAT, en die van Oxnard Foundation en Ella Fitzgerald Stichting HTK zijn ook dankbaar erkend. Onderzoek gemeld in deze publicatie opgenomen werkzaamheden in de Analytical Cytometry Core and Light Microscopie Digital Imaging Core ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder award nummer P30CA33572.
Studie sponsor: De sponsor heeft niet deelgenomen aan de onderzoeksopzet, het verzamelen, analyseren, of de interpretatie van de gegevens.
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
Referências
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells–recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
