In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas
Summary
Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.
Abstract
Souches et les cellules progénitrices du pancréas adultes pourraient être une source potentielle de cellules bêta comme thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de diabète de type 1. Cependant, il est encore impossible de savoir si les cellules souches et progénitrices existent dans le pancréas adulte. Les stratégies de recherche à l'aide de cre-lox lignée-tracing chez les souris adultes ont donné des résultats qui soutiennent ou réfutent l'idée que les cellules bêta peuvent être générées à partir des canaux, l'emplacement présumé où adultes progéniteurs pancréatiques peuvent résider. Ces méthodes de lignage-tracing in vivo cre-lox, cependant, ne peuvent pas répondre aux questions de l' auto-renouvellement et multi-lignage différenciation-deux critères nécessaires pour définir une cellule souche. Pour commencer à répondre à cette lacune technique, nous avons conçu des essais de colonies en 3 dimensions pour progéniteurs pancréatiques. Peu après notre publication initiale, d'autres laboratoires développés indépendamment un similaire, mais pas identique, méthode appelée le test organoide. Par rapport à l'essai organoide, notre méthode emploieméthylcellulose, qui forme des solutions visqueuses qui permettent l'inclusion de protéines de matrice extracellulaire à faibles concentrations. Les essais contenant méthylcellulose-permettent la détection et l'analyse de cellules progénitrices au niveau d'une seule cellule, qui sont critiques quand progéniteurs constituent un petit sous-population plus facile, comme cela est le cas pour de nombreuses cellules souches d'organes adultes. Ensemble, les résultats de plusieurs laboratoires démontrent dans la différenciation in vitro auto-renouvellement et multi-lignée de cellules progénitrices comme pancréatiques de souris. Les protocoles actuels décrivent deux colonies des essais à base de méthylcellulose à caractériser les progéniteurs pancréatiques de souris; une contient une préparation commerciale de protéines de la matrice extracellulaire de souris et l'autre une protéine de matrice extracellulaire artificielle connue sous le nom d'un hydrogel de la laminine. Les techniques présentées ici sont 1) la dissociation du pancréas et le tri des CD133 + Sox9 / EGFP + cellules canalaires de souris adultes, 2) la manipulation de la cellule unique des scellules SOUTENUS, 3) analyse seule colonie en utilisant microfluidique qRT-PCR et l'ensemble de montage immunocoloration, et 4) la dissociation des colonies primaires dans une seule cellule suspensions et re-placage dans des essais de colonies secondaires pour évaluer l'auto-renouvellement ou de la différenciation.
Introduction
Le pancréas se compose de trois principales lignées cellulaires; cellules acineuses sécrètent des enzymes digestives, les conduits sécrètent mucine pour repousser les agents pathogènes et le transport des enzymes digestives dans l'intestin, et les cellules endocrines sécrètent des hormones, y compris l'insuline et le glucagon, qui maintiennent l'homéostasie du glucose. Au cours du développement embryonnaire du pancréas, les cellules canalaires précoces sont la source des cellules progénitrices tri-puissant capable de donner naissance aux trois lignées dans le pancréas d'animaux adultes 1,2. Parce que les cellules souches et progénitrices adultes, telles que les cellules souches de la moelle osseuse, sont déjà utilisés avec succès pour traiter diverses maladies 3, il y a un intérêt intense pour trouver les cellules souches et progénitrices dans le pancréas adulte. Si l'isolement et la manipulation de cellules souches et progénitrices pancréatiques adultes étaient possibles, ces cellules peuvent être utilisées pour traiter des maladies telles que le diabète de type 1, dans lequel les cellules sécrétant de l'insuline sont détruites par auto-immunité.
<p class = "jove_content"> Que les cellules progénitrices tri-puissants existent encore dans les canaux pancréatiques adultes après l'achèvement du développement embryonnaire est une question qui est fortement débattue dans la communauté scientifique. Dans ce débat, et en utilisant in vivo cre-lox lignage techniques de traçage, Inada et ses collègues ont montré que les cellules canalaires murins adultes marqués avec un marqueur, l' anhydrase carbonique II, pourraient donner lieu à tous les trois lignées pancréatiques 4. Cependant, l' utilisation d' autres marqueurs, tels que canalaires HNF1B 5 et Sox9 2, on a conclu que les cellules canalaires ne sont pas la principale source des cellules bêta chez des souris adultes.Il y a plusieurs années, nous avons proposé que la cause du débat précité peut être dû à l'absence, dans le domaine de 6,7, des outils d' analyse appropriés qui peuvent être utilisés pour mesurer l' auto-renouvellement et de multi-lignage différenciation-deux critères nécessaires pour définir une cellule souche. La technique in vivo de la lignée de traçage cre-lox dans mentionnéci-dessus peuvent fournir des preuves de la relation progéniteur-descendants au niveau de la population. Cependant, cette technique de traçage de la lignée est limitée dans son pouvoir de discerner si les cellules progénitrices simples peuvent se renouveler et de se différencier en plusieurs lignées. analyse unicellulaire est importante, car si plusieurs progéniteurs mono puissants, chacun ayant un potentiel de lignée différente, ont été analysés ensemble, ils peuvent apparaître collectivement avoir de lignées multiples capacités de différenciation. En outre, les cellules souches sont habituellement une population mineure d'un organe adulte. Les activités d'une population de cellules mineures pourraient être masqués par la population majeure. Par conséquent, un résultat négatif à partir d'une étude de population ne signifie pas nécessairement l'absence de cellules souches. Enfin, cre-lox lignée traçage ne permet pas actuellement la mesure de l'auto-renouvellement.
Pour commencer à répondre à l'écart technique dans le domaine de la biologie du pancréas de cellules progénitrices, colonie 7-11 ou 12-15 organoide </sup> essais utilisant des systèmes de culture 3D ont été conçus. Deux essais de colonies pour progéniteurs pancréatiques ont été développés dans notre laboratoire: l' un contient une préparation commerciale de murins protéines de la matrice extracellulaire (ECM) (voir Méthodes et Tableau équipement), et l'autre contient la laminine hydrogel, une artificielle protéine ECM définie 7-11. Les cellules progénitrices sont mélangés dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Methylcellulose est un matériau biologiquement inerte et visqueux préparé à partir de fibres de bois et a été utilisée en routine dans des essais de colonies hématopoïétiques 16. La méthylcellulose contenant un milieu semi-solide limite le mouvement de cellules souches individuelles de sorte qu'elles ne peuvent pas re-agrégat. Pourtant, le milieu est suffisamment souple pour permettre une cellule progénitrice de croître et de se différencier en une colonie de cellules dans l'espace 3D. Suivant la tradition des hématologues, une cellule pancréatique progénitrices qui a été capable de donner naissance à une colonie de cellules était named une unité formant colonie pancréatique (PCFU). PCFUs, lorsqu'il est cultivé dans l'essai de colonie contenant ECM-murin, donnent naissance à des colonies kystiques qui sont nommés colonies "Ring" 7. Lors de l' addition d'un agoniste Wnt, R-spondin1, dans la culture contenant de l' ECM-murin, certaines colonies Anneau transformer en colonies "denses" 7. Dans cet article, ces deux types de colonies cultivées dans la culture de l'ECM murin sont collectivement appelés «anneaux / denses" colonies. Lorsque Ring / colonies denses sont dissociées en suspension cellulaire unique et re-plaqué dans les cultures qui contiennent laminine hydrogel, colonies "Endocrine / acineuses" sont formés 7.
En utilisant une seule colonie analyses, il a été constaté que la majorité des colonies Ring / denses et Endocrine / acineuses, soit à partir des adultes (2-4 month-old) 7,11 ou jeune (1 week-old) 9 pancréas de souris, d' exprimer tous les trois marqueurs de la lignée. Cela suggère que la plupart des PCFUs originaires sont tri-puissant. Dans l'essai de colonies contenant ECM-murin, PCFUs murin adulte robuste auto-renouvellement et l' expansion d' environ 500.000 fois plus de 11 semaines dans la culture 7. ECM murine supporte de préférence la différenciation des cellules canalaires sur le système endocrinien et acineuses lignées, tandis qu'en présence de laminine hydrogel PCFUs murins sont encouragés à se différencier préférentiellement dans les cellules endocrines et acineuses et moins à la lignée canalaire 7,9,11. Surtout, Insuline Glucagon + – Les cellules mono-hormonal sont générés dans la culture d'hydrogel de la laminine et de sécréter de l' insuline en réponse au glucose in vitro de stimulation de 7,9, ce qui suggère la maturité fonctionnelle. La différenciation potentielle 7,9 tri-lignée et l' auto-renouvellement de 11 PCFUs individuels sont confirmés par micromanipulation une seule cellule, à savoir, la mise en culture d' une cellule par puits pour la formation de colonies. Ensemble, ces résultats fournissent des preuves qu'il existe des auto-renouvellement, le tri-potenT, des cellules souches, comme dans le pancréas de souris post-natale qui montrent des activités dans la culture 3D.
Les essais de PCFU murins décrits dans cet article sont issus d'un essai de colonie avant conçu pour les cellules progénitrices différenciées à partir de cellules murines embryonnaires souches (mESCs) 17. Ce protocole est documenté en détail dans une autre publication JoVE 18. Les composants et les techniques nécessaires pour réaliser le dosage de la colonie de souris contenant ECM pour adultes PCFUs culture sont les mêmes que pour les progéniteurs MESC dérivées 17,18. Par conséquent, ces aspects de l'essai ne seront pas répétées ici; place les procédures suivantes seront abordées: 1) la dissociation du pancréas adulte et de tri CD133 + Sox9 / EGFP + cellules canalaires, qui enrichissent PCFUs de souris adultes 7, 2) la manipulation de cellules isolées des cellules triées, 3) une seule colonie analyses utilisant microfluidique qRT-PCR et l'ensemble de montage immunocoloration, et 4) la dissociation de colonies en suspension à cellule unique et re-placage dans ECM murin ou laminine essais hydrogel de colonies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les essais de colonies pancréatiques et seule colonie analyses décrites ici ont été inspirés par les hématopoïétiques essais de colonies contenant de méthylcellulose qui ont joué un rôle majeur dans le décryptage de la biologie des cellules souches hématopoïétiques dans les dernières décennies 23. Dans ces essais (Figure 5), dissociées des cellules pancréatiques sont étalées dans des milieux semi-solides avec des facteurs de croissance appropriés et des protéines d'…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Lucy Brown et Alexander Spalla de l'analyse de cytométrie de base à City of Hope de l'aide pour le tri. Ce travail est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01DK081587 et R01DK099734 à HTK et U01DK089533 à l'ADR, et par la National Science Foundation subvention NSF-DMR-1206121 et en Californie Institute for Regenerative Medicine subvention RB5-07398 à DAT Supports de l'Institut J. Joseph Jacobs pour le génie moléculaire pour la médecine à Caltech à DAT, et ceux de la Fondation Oxnard et la Fondation Ella Fitzgerald à HTK sont également appréciés.
Financement: Ce travail est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01DK081587 et R01DK099734 à HTK et U01DK089533 à l' ADR, et par la National Science Foundation subvention NSF-DMR-1206121 et en Californie Institute for Regenerative Medicine subvention RB5-07398 à DAT Prise en charge de la Joseph J. JacobsInstitut d'ingénierie moléculaire pour la médecine à Caltech à DAT, et ceux de la Fondation Oxnard et Ella Fitzgerald Foundation à HTK sont également très précieuse. La recherche rapportée dans cette publication inclus les travaux effectués dans l'analyse de cytométrie de base et de microscopie optique numérique Imaging Core soutenu par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous le numéro d'attribution P30CA33572.
Commanditaire de l' étude: Le promoteur n'a pas participé à la conception de l' étude, la collecte, l' analyse ou l' interprétation des données.
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
Referências
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