इन विट्रो कॉलोनी assays में त्रिकोणीय शक्तिशाली पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं निस्र्पक के लिए एडल्ट Murine अग्न्याशय से पृथक
Summary
आत्म नवीकरण और वयस्क murine अग्न्याशय से अलग पूर्वज कोशिकाओं की भिन्नता का पता लगाने के लिए इन विट्रो कॉलोनी assays में तैयार कर रहे हैं। इन assays में, अग्नाशय के पूर्वज methylcellulose युक्त अर्द्ध ठोस माध्यम में 3-आयामी अंतरिक्ष में सेल कालोनियों को जन्म दे। एकल कक्षों और अलग-अलग कालोनियों के लक्षण वर्णन से निपटने के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं।
Abstract
स्टेम और वयस्क अग्न्याशय से पूर्वज कोशिकाओं टाइप 1 मधुमेह के रोगियों के उपचार के लिए चिकित्सकीय बीटा कोशिकाओं की तरह का एक संभावित स्रोत हो सकता है। हालांकि, यह स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज वयस्क अग्न्याशय में मौजूद है कि क्या अभी भी अज्ञात है। सीआरई-Lox वयस्क चूहों में वंश अनुरेखण का उपयोग कर अनुसंधान रणनीतियों परिणाम है कि या तो समर्थन या विचार है कि बीटा कोशिकाओं नलिकाओं, माना स्थान जहां वयस्क अग्नाशय पूर्वज निवास कर सकते हैं से उत्पन्न किया जा सकता खंडन मिले हैं। इन विवो सीआरई-Lox वंश अनुरेखण विधियों, हालांकि, आत्म नवीकरण और बहु-वंश भेदभाव-दो एक स्टेम सेल को परिभाषित करने के लिए आवश्यक मानदंडों के सवालों का जवाब नहीं कर सकते हैं। इस तकनीकी खाई को संबोधित शुरू करने के लिए, हम अग्नाशय progenitors के लिए 3-आयामी कॉलोनी assays तैयार की। जल्द ही हमारी प्रारंभिक प्रकाशन के बाद, अन्य प्रयोगशालाओं स्वतंत्र रूप से एक समान है, लेकिन समान नहीं, विधि organoid परख बुलाया विकसित की है। organoid परख की तुलना में हमारे विधि को रोजगारmethylcellulose, जो चिपचिपा समाधान है कि कम मात्रा में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के शामिल किए जाने की अनुमति देने के रूपों। methylcellulose युक्त assays, आसान पता लगाने और एकल कोशिका के स्तर पर पूर्वज कोशिकाओं है, जो महत्वपूर्ण हैं जब पूर्वज एक छोटे उप जनसंख्या गठन के विश्लेषण की अनुमति के रूप में कई वयस्क स्टेम कोशिकाओं अंग के लिए मामला है। साथ में, कई प्रयोगशालाओं से परिणाम चूहों से अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं की तरह की इन विट्रो आत्म नवीकरण और बहु-वंश भेदभाव में प्रदर्शित करता है। मौजूदा प्रोटोकॉल दो methylcellulose आधारित कॉलोनी माउस अग्नाशय पूर्वज को चिह्नित करने assays का वर्णन; एक murine बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की एक वाणिज्यिक तैयारी और अन्य एक कृत्रिम बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन एक laminin हाइड्रोजेल के रूप में जाना होता है। यहाँ दिखाया तकनीक 1) अग्न्याशय की हदबंदी और CD133 + Sox9 / EGFP की छँटाई वयस्क चूहों से + नलीपरक कोशिकाओं, 2) एस के एकल कक्ष में गड़बड़ी हैंorted कोशिकाओं, 3) एकल कॉलोनी माध्यमिक कॉलोनी assays में microfluidic QRT- पीसीआर और पूरे माउंट immunostaining, और 4) प्राथमिक कालोनियों के एकल कोशिका निलंबन और फिर से चढ़ाना में हदबंदी का उपयोग कर आत्म नवीकरण या भेदभाव का आकलन करने के लिए विश्लेषण करती है।
Introduction
अग्न्याशय के तीन प्रमुख सेल प्रजातियों से बना है; कोष्ठकी कोशिकाओं छिपाना पाचक एंजाइम, नलिकाएं रोगजनकों से रोकना और पेट के लिए पाचन एंजाइमों के परिवहन के लिए mucin छिपाना, और अंत: स्रावी कोशिकाओं को इंसुलिन और ग्लूकागन सहित हार्मोन है, कि ग्लूकोज homeostasis को बनाए रखने छिपाना। अग्न्याशय के भ्रूण के विकास के दौरान, जल्दी नलीपरक कोशिकाओं त्रिकोणीय शक्तिशाली पूर्वज वयस्क जानवरों 1,2 के Pancreata में तीन प्रजातियों को जन्म देने में सक्षम कोशिकाओं का स्रोत हैं। क्योंकि इस तरह अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं के रूप में वयस्क स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज, पहले से ही सफलतापूर्वक विभिन्न रोगों 3 इलाज के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, वहाँ वयस्क अग्न्याशय में स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज खोजने में गहन रुचि है। तो अलगाव और वयस्क स्टेम अग्नाशय और पूर्वज कोशिकाओं के हेरफेर संभव हो गया है, इन कोशिकाओं जैसे टाइप 1 मधुमेह, जिसमें इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं औतोइम्मुिनित से नष्ट हो रहे रोगों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
<p clasएस = "jove_content"> त्रिकोणीय शक्तिशाली पूर्वज कोशिकाओं को अभी भी वयस्क अग्नाशय नलिकाओं में मौजूद हैं के बाद भ्रूण के विकास के पूरा होने के एक सवाल है कि भारी वैज्ञानिक समुदाय में बहस हो रही है है। इस बहस में, और प्रयोग करने में विवो सीआरई-Lox वंश अनुरेखण तकनीक, Inada और सहकर्मियों से पता चला है कि वयस्क murine नलीपरक एक मार्कर, कार्बोनिक anhydrase द्वितीय के साथ लेबल की कोशिकाओं, सभी तीन अग्नाशय प्रजातियों 4 को जन्म दे सकता है। हालांकि, इस तरह HNF1b 5 और Sox9 2 के रूप में अन्य नलीपरक मार्कर का उपयोग करते हुए, यह निष्कर्ष निकाला गया था कि नलीपरक कोशिकाओं वयस्क चूहों में बीटा कोशिकाओं का प्रमुख स्रोत नहीं हैं।कई साल पहले, हम प्रस्ताव किया है कि ऊपर उल्लिखित बहस का कारण कमी के कारण हो सकता है, क्षेत्र 6.7 में, उचित विश्लेषणात्मक उपकरण है कि आत्म नवीकरण और बहु-वंश भेदभाव-दो मापदंड आवश्यक को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक स्टेम सेल को परिभाषित। इन विवो सीआरई-Lox वंश अनुरेखण तकनीक का उल्लेखऊपर आबादी स्तर पर पूर्वज-संतान रिश्ते के लिए सबूत प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, इस वंश अनुरेखण तकनीक विचार करने के लिए एक पूर्वज कोशिकाओं कर सकते हैं आत्म नवीकरण और कई प्रजातियों में अंतर है कि क्या अपनी शक्ति में सीमित है। एकल कोशिका विश्लेषण महत्वपूर्ण है क्योंकि अगर कई मोनो शक्तिशाली पूर्वज, एक अलग वंश क्षमता के साथ प्रत्येक, एक साथ विश्लेषण किया गया है, वे सामूहिक रूप से बहु-वंश भेदभाव क्षमता है करने के लिए प्रकट हो सकता है। इसके अलावा, स्टेम कोशिकाओं को आम तौर पर एक वयस्क अंग की एक नाबालिग आबादी है। एक छोटी सी सेल की आबादी की गतिविधियों प्रमुख जनसंख्या से छिपा हुआ जा सकता है। इसलिए, एक जनसंख्या अध्ययन से एक नकारात्मक परिणाम जरूरी स्टेम कोशिकाओं के अभाव का संकेत नहीं है। अंत में, सीआरई-Lox वंश अनुरेखण वर्तमान में आत्म नवीकरण की माप की अनुमति नहीं है।
अग्नाशय के पूर्वज कोशिका जीव विज्ञान, कॉलोनी के क्षेत्र में तकनीकी खाई को संबोधित शुरू करने के लिए 7-11 या 12-15 organoid </sup> 3 डी संस्कृति सिस्टम का उपयोग कर assays तैयार कर लिया गया था। अग्नाशय के progenitors के लिए दो कॉलोनी assays हमारी प्रयोगशाला में विकसित किए गए: एक murine बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन (ईसीएम) (तरीकों और उपकरणों तालिका देखें) के एक व्यावसायिक तैयारी में शामिल है, और अन्य laminin हाइड्रोजेल, एक परिभाषित कृत्रिम ईसीएम प्रोटीन 7-11 होता है। पूर्वज कोशिकाओं अर्द्ध ठोस मध्यम युक्त methylcellulose में मिलाया जाता है। Methylcellulose एक जैविक निष्क्रिय और चिपचिपा लकड़ी फाइबर से तैयार सामग्री है, और नियमित रूप से hematopoietic कॉलोनी assays के 16 में इस्तेमाल किया गया है। methylcellulose युक्त अर्द्ध ठोस मध्यम एकल पूर्वज कोशिकाओं की आवाजाही प्रतिबंधित है ताकि वे फिर से समग्र नहीं कर सकते। फिर भी, मध्यम काफी नरम एक पूर्वज सेल बढ़ने और 3 डी अंतरिक्ष में कोशिकाओं की एक कॉलोनी में अंतर करने की अनुमति है। hematologists की परंपरा के बाद, एक अग्नाशय के पूर्वज सेल कि कोशिकाओं की एक कॉलोनी को जन्म देने में सक्षम था n थाएक अग्नाशय कॉलोनी के गठन इकाई amed (PCFU)। PCFUs, जब murine ईसीएम युक्त कॉलोनी परख में हो, पित्ताशय कालोनियों "अँगूठी" कालोनियों 7 नामित कर रहे हैं कि को जन्म दे। एक Wnt एगोनिस्ट के अलावा पर, आर spondin1, murine ईसीएम युक्त संस्कृति में, कुछ अंगूठी कालोनियों "घने" कालोनियों 7 में बदल जाते हैं। इस अनुच्छेद में, murine ईसीएम संस्कृति में विकसित कालोनियों के इन दो प्रकार के सामूहिक रूप से "अंगूठी / घने" कालोनियों के लिए भेजा जाता है। रिंग / घने कालोनियों एकल कक्ष निलंबन में अलग कर रहे हैं और संस्कृतियों है कि laminin हाइड्रोजेल रोकने में फिर से चढ़ाया है, "Endocrine / कोष्ठकी" कालोनियों 7 बनते हैं।
एकल कॉलोनी विश्लेषण का उपयोग कर, यह पाया गया कि अंगूठी / घने और Endocrine / कोष्ठकी कालोनियों का बहुमत है, या तो वयस्क से (2-4 महीने की उम्र में) 7,11 या युवा (1 सप्ताह पुराने) 9 murine अग्न्याशय, सभी तीन का इजहार वंश मार्करों। यह पता चलता है कि होने वाले PCFUs के सबसे त्रिकोणीय शक्तिशाली हैं। Murine ईसीएम युक्त कॉलोनी परख में, वयस्क murine PCFUs मजबूती के साथ आत्म नवीकरण और संस्कृति 7 में 11 सप्ताह से अधिक लगभग 500,000 बार विस्तार। Murine ईसीएम रियायत के तौर पर, अंत: स्रावी और कोष्ठकी प्रजातियों के ऊपर नलीपरक कोशिकाओं के भेदभाव का समर्थन करता है, जबकि laminin हाइड्रोजेल की उपस्थिति में, murine PCFUs और अंत: स्रावी और कोष्ठकी कोशिकाओं में रियायत के अंतर करने के लिए प्रोत्साहित किया नलीपरक वंश 7,9,11 के लिए इतना कम कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, इंसुलिन + ग्लूकागन – मोनो हार्मोनल कोशिकाओं laminin हाइड्रोजेल संस्कृति में उत्पन्न होता है और जवाब में इंसुलिन स्रावित विट्रो 7.9 में उत्तेजना ग्लूकोज, कार्यात्मक परिपक्वता सुझाव दे रहे हैं। त्रि-वंश भेदभाव संभावित 7.9 और व्यक्तिगत PCFUs की आत्म नवीकरण 11, एकल कोशिका micromanipulation, यानी द्वारा की पुष्टि की कॉलोनी गठन के लिए अच्छी तरह से प्रति एक कोशिका संवर्धन कर रहे हैं। साथ में, इन परिणामों स्वयं renewing, सप्ताह में तीन पोतेन देखते हैं कि सबूत प्रदानटी, प्रसव के बाद murine अग्न्याशय में पूर्वज कोशिकाओं की तरह चलता है कि 3 डी संस्कृति में गतिविधियों।
इस आलेख में वर्णित murine PCFU assays murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs) 17 से भेदभाव पूर्वज कोशिकाओं के लिए बनाया गया एक पूर्व कॉलोनी परख से निकाली गई है। यही कारण है कि प्रोटोकॉल एक और जौव प्रकाशन 18 में विस्तार से प्रलेखित है। संस्कृति के घटकों और वयस्क PCFUs के लिए murine ईसीएम युक्त कॉलोनी परख करने के लिए आवश्यक तकनीक mESC व्युत्पन्न progenitors 17,18 के लिए के रूप में ही हैं। इसलिए, परख के इन पहलुओं यहाँ दोहराया नहीं किया जाएगा; बजाय निम्नलिखित प्रक्रियाओं को संबोधित किया जाएगा: 1) वयस्क अग्न्याशय की हदबंदी और CD133 + Sox9 / EGFP + नलीपरक कोशिकाओं है, जो वयस्क चूहों 7, 2) हल कोशिकाओं की एकल कोशिका में गड़बड़ी, 3) एकल कॉलोनी से PCFUs को समृद्ध छँटाई microfluidic QRT- पीसीआर और पूरे माउंट immunostaining, और 4) Colonie की हदबंदी का उपयोग कर विश्लेषण करती हैएकल कक्ष निलंबन और एस में murine ईसीएम या laminin हाइड्रोजेल कॉलोनी assays में फिर से चढ़ाना।
Protocol
Representative Results
Discussion
अग्नाशय कॉलोनी assays और एकल कॉलोनी यहाँ वर्णित विश्लेषण methylcellulose युक्त hematopoietic कॉलोनी assays पिछले दशकों 23 हीमैटोपोयटिक पूर्वज कोशिकाओं के जीव विज्ञान का गूढ़ रहस्य में प्रमुख भूमिका निभाई है कि से प्रेरित थ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम लूसी ब्राउन और अलेक्जेंडर spalla छँटाई में सहायता के लिए आशा की सिटी में विश्लेषणात्मक Cytometry कोर से धन्यवाद देता हूं। इस काम के स्वास्थ्य (एनआईएच) के राष्ट्रीय संस्थानों डैट समर्थन करने के लिए पुनर्योजी चिकित्सा अनुदान RB5-07398 के लिए R01DK081587 और R01DK099734 HTK करने के लिए, और एडीआर के लिए U01DK089533, और अनुदान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान NSF-DMR-1206121 और कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट द्वारा द्वारा समर्थित है यूसुफ जे याकूब आण्विक इंजीनियरिंग के लिए चिकित्सा के लिए कैलटेक में डैट के लिए HTK करने के लिए संस्थान, और Oxnard फाउंडेशन और एला फाउंडेशन की ओर से उन लोगों से भी कर रहे हैं आभार स्वीकार किया।
अनुदान: इस काम के स्वास्थ्य (एनआईएच) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है HTK को R01DK081587 और R01DK099734 अनुदान, और एडीआर के लिए U01DK089533, और पुनर्योजी चिकित्सा अनुदान RB5-07398 के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान NSF-DMR-1206121 और कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट द्वारा डैट यूसुफ जे याकूब से समर्थन करता हैसंस्थान डैट को कैलटेक में चिकित्सा के लिए आण्विक इंजीनियरिंग के लिए, और Oxnard फाउंडेशन और HTK को एला फाउंडेशन की ओर से उन लोगों को भी आभार स्वीकार कर रहे हैं। अनुसंधान इस प्रकाशन में सूचना विश्लेषणात्मक Cytometry कोर और प्रकाश माइक्रोस्कोपी डिजिटल इमेजिंग कोर के तहत पुरस्कार नंबर P30CA33572 राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित में निष्पादित कार्य शामिल थे।
अध्ययन का प्रायोजक: प्रायोजक अध्ययन डिजाइन, संग्रह, विश्लेषण, या डेटा की व्याख्या में भाग नहीं लिया।
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
Referências
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