In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas
Summary
Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.
Abstract
Stem e células progenitoras do pâncreas adultos poderia ser uma fonte potencial de células beta como terapêuticos para o tratamento de pacientes com diabetes do tipo 1. No entanto, ainda é desconhecido se existem células estaminais e progenitoras no pâncreas adulto. estratégias de pesquisa usando cre-lox linhagem-tracing em ratos adultos têm rendido resultados que apoiar ou refutar a ideia de que as células beta podem ser gerados a partir dos dutos, a localização presumida quando adultas progenitoras pancreáticas podem residir. Estes métodos de rastreamento de linhagem in vivo cre-lox, no entanto, não pode responder às perguntas de auto-renovação e multi-linhagem de diferenciação e dois critérios necessários para definir uma célula-tronco. Para começar a abordar esta lacuna técnica, eu inventei ensaios de colónias 3-dimensionais para progenitores pancreáticas. Logo após a publicação inicial, outros laboratórios desenvolveram independentemente um semelhante, mas não idêntico, método chamado o ensaio organ�de. Em comparação com o ensaio de organ�de, o nosso método empregametilcelulose, que forma soluções viscosas que permitem a inclusão de proteínas de matriz extracelular em baixas concentrações. Os ensaios de metilcelulose contendo permitir a detecção e análise das células progenitoras para o nível de uma única célula, que são críticos quando progenitoras constituem uma pequena sub-população mais fácil, como é o caso de muitas células estaminais adultas de órgãos. Juntos, os resultados de vários laboratórios demonstrar in vitro de auto-renovação e multi-linhagem diferenciação de células progenitoras semelhante pancreáticas de ratos. Os protocolos atuais descrevem dois ensaios de colónias à base de metilcelulose para caracterizar progenitores rato pancreáticas; um contém uma preparação comercial de proteínas da matriz extracelular de murino e o outro uma proteína da matriz extracelular artificial conhecido como um hidrogel laminina. As técnicas aqui descritas são: 1) dissociação do pâncreas e triagem de CD133 + Sox9 / eGFP + ductais de ratos adultos, 2) manipulação de uma única célula das scélulas orted, 3) analisa única colônia usando 4) dissociação de colónias primárias em uma única célula suspensões e re-plaqueamento microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, e em ensaios de colónias secundárias para avaliar a auto-renovação ou diferenciação.
Introduction
O pâncreas é composto por três grandes linhagens celulares; células acinares secretam enzimas digestivas, dutos segregam mucina para se defender de agentes patogénicos e transportar enzimas digestivas para o intestino, e células endócrinas secretam hormônios, incluindo a insulina e glucagon, que mantêm a homeostase da glicose. Durante o desenvolvimento embrionário do pâncreas, as células ductais primeiros são a fonte das células progenitoras tri-potentes, capazes de dar origem às três linhagens no pâncreas dos animais adultos 1,2. Como as células estaminais e progenitoras adultas, tais como células estaminais da medula óssea, são já utilizados com sucesso no tratamento de várias doenças 3, existe grande interesse em encontrar as células estaminais e progenitoras no pâncreas adulto. Se o isolamento e manipulação de células estaminais e progenitoras adultas pancreáticos eram possíveis, estas células podem ser usadas para o tratamento de doenças tais como diabetes do tipo 1, em que as células secretoras de insulina são destruídas por auto-imunidade.
<p class = "jove_content"> Se as células progenitoras tri-potente ainda existem em ductos pancreáticos adultos após a conclusão do desenvolvimento embrionário é uma pergunta que é fortemente debatida na comunidade científica. Neste debate, e usando in vivo cre-lox-linhagem rastreamento técnicas, Inada e colaboradores mostraram que as células do ducto murino adulto marcadas com um marcador, anidrase carbônica II, poderia dar origem a todos os três linhagens pancreáticas 4. No entanto, o uso de outros marcadores, tais como ductais HNF1B 5 e 2 Sox9, concluiu-se que as células ductais não são a principal fonte de células beta em ratos adultos.Vários anos atrás, foi proposto que a causa da discussão acima mencionado pode ser devido à falta, na área 6,7, de ferramentas analíticas adequadas que podem ser utilizadas para medir a auto-renovação e multi-linhagem diferenciação dois critérios necessário definir uma célula estaminal. O vivo técnica de rastreamento de linhagem em cre-lox mencionadoacima pode fornecer evidência para a relação progenitor-descendência em um nível populacional. No entanto, esta técnica traçar a linhagem é limitado em seu poder para discernir se as células progenitoras individuais podem auto-renovar e diferenciar em várias linhagens. análise de uma única célula é importante porque se vários progenitores mono-potente, cada um com um potencial de linhagem diferente, foram analisados em conjunto, eles podem aparecer em conjunto para ter capacidades de diferenciação multi-linhagem. Além disso, as células estaminais são normalmente uma população menor de um órgão adulto. As actividades de uma população de células menor pode ser mascarado pela maior população. Portanto, um resultado negativo de um estudo populacional não indica necessariamente a ausência de células-tronco. Finalmente, cre-lox linhagem rastreamento atualmente não permite a medição de auto-renovação.
Para começar a abordar a lacuna técnica no campo da biologia de células progenitoras do pâncreas, colônia 7-11 ou 12-15 organ�de </sup> ensaios utilizando sistemas de cultura 3D foram concebidos. Dois ensaios de colónias de progenitores pancreáticos foram desenvolvidos no nosso laboratório: uma contém uma preparação comercial de proteínas murinas da matriz extracelular (ECM) (ver Tabela Métodos e do equipamento), e o outro contém hidrogel laminina, uma proteína da MEC artificial definido 7-11. As células progenitoras são misturados em meio semi-sólido contendo metilcelulose. A metilcelulose é um material biologicamente inerte e viscosa preparada a partir de fibras de madeira, e tem sido utilizada rotineiramente em ensaios de colónias hematopoiéticas 16. O meio semi-sólido contendo metilcelulose-restringe o movimento das células progenitoras individuais de modo que não pode voltar a agregado. No entanto, a forma é suficientemente mole para permitir que uma célula progenitora para crescer e se diferenciam em células de uma colónia no espaço 3D. Seguindo a tradição dos hematologistas, uma célula progenitora pancreático que foi capaz de dar origem a uma colônia de células foi named uma unidade de formação de colónias do pâncreas (PCFU). PCFUs, quando cultivada no ensaio colónia contendo ECM murino, dão origem a colônias císticos que são nomeados "anel" colônias 7. Após a adição de um agonista de Wnt, R-spondin1, na cultura contendo ECM murino, algumas colónias anel transformar em colónias "densas" 7. Neste artigo, estes dois tipos de colônias crescidas em cultura ECM murino são colectivamente referidos como colônias "anel / densas". Quando anel / colônias densas são dissociados em suspensão única célula e re-banhado em culturas que contêm laminina hidrogel, colônias "Endocrine / acinares" são formadas 7.
Usando única colônia análises, verificou-se que a maioria das colônias Anel / densas e Endócrino / acinares, quer a partir de adultos (2-4 meses de idade) 7,11 ou jovens (1 semana de idade) 9 pâncreas murino, expressar todos os três marcadores de linhagem. Isto sugere que a maioria dos PCFUs originárias são tri-potente. No ensaio colónia contendo ECM murino, adulto PCFUs murino robustamente auto-renovar e expandir cerca de 500.000 vezes mais de 11 semanas em cultura 7. ECM murino preferencialmente apoia a diferenciação de células ductais mais endócrinas e acinares linhagens, ao passo que na presença de hidrogel laminina, PCFUs murino são encorajados a diferenciar-se preferencialmente em células endócrinas e acinares e menos para a linhagem ductal 7,9,11. Importante, Insulina Glucagon + – células mono-hormonal são geradas na cultura hidrogel laminina e segregam insulina em resposta à glicose estimulação in vitro de 7,9, sugerindo a maturidade funcional. A diferenciação tri-linhagem potencial de 7,9 e auto-renovação 11 de PCFUs individuais são confirmados por micromanipulação de uma única célula, ou seja, a cultura de uma célula por poço para a formação de colónias. Juntos, estes resultados fornecem evidências de que há auto-renovação, tri-potent, células progenitoras-like no pâncreas murino pós-natal que mostram actividades na cultura 3D.
Os ensaios PCFU murino descritas neste artigo são derivados a partir de um ensaio de colónias antes concebido para células progenitoras diferenciadas a partir de células estaminais embrionárias de murídeo (17) mESCs. Esse protocolo está documentada em detalhes em outra publicação JoVE 18. Os componentes e as técnicas necessárias para realizar o ensaio de colónias contendo ECM murino para adultos PCFUs cultura são os mesmos que para os progenitores derivados MESC-17,18. Portanto, estes aspectos do ensaio não será repetido aqui; em vez disso, ser dirigida os seguintes procedimentos: 1) dissociação do pâncreas adulto e triagem + células CD133 + Sox9 / EGFP ductais, que enriquecem PCFUs a partir de ratinhos adultos 7, 2) manipulação de uma única célula das células separadas, 3) uma única colónia análises usando 4) dissociação do colonie microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, es em suspensão de uma única célula e re-plaqueamento em ECM murino ou laminina ensaios hidrogel colônia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os ensaios de colónias pancreáticas e colónia única análises descritas aqui foram inspirados pelos ensaios de colónias hematopoiéticas contendo metilcelulose que têm desempenhado papéis importantes em decifrar a biologia das células progenitoras hematopoiéticas nas últimas décadas 23. Nestes ensaios (Figura 5), dissociado células pancreáticas são plaqueadas em metilcelulose contendo meio de cultura semi-sólido com factores de crescimento apropriadas e proteínas da MEC que su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Lucy Brown e Alexander Spalla da Analytical Citometria Núcleo at City of Hope para assistência na classificação. Este trabalho é apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 para HTK e U01DK089533 de ADR, e pela National Science Foundation subvenção NSF-DMR-1206121 e California Institute for Regenerative Medicine RB5-07398 concessão para DAT Apoia do J. Instituto Joseph Jacobs para a engenharia molecular de Medicina da Caltech para DAT, e os da Fundação Oxnard e Ella Fitzgerald Fundação para HTK também são reconhecido agradecimento.
Financiamento: Este trabalho é apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 para HTK e U01DK089533 para ADR e pelo Instituto Nacional Science Foundation subvenção NSF-DMR-1206121 e Medicina Regenerativa da Califórnia RB5-07398 subvenção para DAT Suporta do Joseph J. JacobsInstituto de Engenharia Molecular de Medicina da Caltech para DAT, e os da Fundação Oxnard e Ella Fitzgerald Fundação para HTK também estão reconhecido agradecimento. Pesquisa relatada nesta publicação incluiu o trabalho realizado no Analytical Citometria Core e Microscopia de Luz Digital Imaging Núcleo apoiado pelo National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio P30CA33572.
Patrocinador do estudo: O patrocinador não participou no desenho do estudo, coleta, análise ou interpretação dos dados.
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
Referências
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells–recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
