In Vitro Colony analyser för att karakterisera Tri-potenta stamceller isolerade från vuxen Murina bukspottkörtel
Summary
In vitro kolonianalyser för att upptäcka självförnyelse och differentiering av stamceller som isolerats från vuxna murina bukspottkörteln utformas. I dessa analyser, pankreas stamceller ger upphov till cellkolonier i tre-dimensionell rymd i metylcellulosa innehållande halvfast medium. Protokoll för hantering av enskilda celler och karakterisering av enskilda kolonier beskrivs.
Abstract
Stem och progenitorceller från vuxna bukspottkörteln kan vara en potentiell källa av terapeutiska beta-liknande celler för behandling av patienter med typ 1-diabetes. Emellertid är det fortfarande okänt om stam- och stamfaderceller föreligger i den vuxna bukspottkörteln. Forskningsstrategier som använder cre-lox härstamning-spårning i vuxna möss har gett resultat som antingen stöd eller vederlägga idén att betacellerna kan genereras från kanalerna, den förmodade platsen där vuxna bukspottkörteln stamceller kan uppehålla sig. Dessa in vivo cre-lox linje-spårning metoder, dock inte kan svara på frågor om självförnyelse och flera härstamning differentiering-två kriterier som krävs för att definiera en stamcell. Till att börja ta itu med denna tekniska klyftan, utarbetade vi tre-dimensionella kolonianalyser för bukspottkörteln stamceller. Strax efter vår första publikation, andra laboratorier oberoende utvecklat en liknande, men inte identiska, metod som kallas organoid analysen. Jämfört med organoid analysen använder vår metodmetylcellulosa, som bildar viskösa lösningar som tillåter införande av extracellulära matrixproteiner vid låga koncentrationer. Metylcellulosa innehållande analyser tillåter lättare att upptäcka och analyser av progenitorceller vid encelliga nivå, som är kritisk när stamceller utgör en liten subpopulation, vilket är fallet för många vuxna organ stamceller. Tillsammans resultat från flera laboratorier visar i självförnyelse och flera härstamning vitro differentiering av pankreas stamceller-liknande celler från möss. De nuvarande protokoll beskriver två metylcellulosa-baserade kolonianalyser för att karakterisera mus pankreatiska progenitorceller; en innehåller ett kommersiellt preparat av murina extracellulära matrisproteiner och den andra en artificiell extracellulärt matrisprotein känt som ett laminin hydrogel. De tekniker som visas här är ett) dissociation i bukspottkörteln och sortering av CD133 + Sox9 / EGFP + duktala celler från vuxna möss, 2) enskild cell manipulation av sorted celler, 3) enda koloni analyser med hjälp av mikroflödes QRT-PCR och hel-mount immunofärgning, och 4) dissociation av primära kolonier i encelliga suspensioner och åter-plating i sekundära kolonianalyser för att bedöma självförnyelse eller differentiering.
Introduction
Bukspottkörteln består av tre stora cellinjer; körtelceller utsöndrar matsmältningsenzymer, utsöndrar kanaler mucin att parera patogener och transportera matsmältningsenzymer till tarmen, och endokrina celler utsöndrar hormoner, inklusive insulin och glukagon, som upprätthåller glukoshomeostas. Under fosterutvecklingen i bukspottkörteln, de tidiga duktala celler är källan till tri-potent progenitorceller som kan ge upphov till de tre linjerna i pankreata av vuxna djur 1,2. Eftersom vuxna stam- och stamfaderceller, såsom benmärgsstamceller, är redan framgångsrikt använts för att behandla olika sjukdomar 3, det finns stort intresse i att finna de stam- och stamfaderceller i den vuxna bukspottkörteln. Om isolering och manipulering av vuxna pankreatiska stam- och stamfaderceller vore möjligt skulle dessa celler kunna användas för att behandla sjukdomar såsom typ 1-diabetes, i vilken de insulinutsöndrande cellerna förstörs av autoimmunitet.
<p class = "jove_content"> Huruvida tri-potent progenitorceller förekommer fortfarande hos vuxna pankreas kanaler efter slutförandet av embryonal utveckling är en fråga som är starkt diskuteras i forskarvärlden. I denna debatt, och med hjälp av in vivo cre-lox härstamning-tracing tekniker, inada och medarbetare visade att vuxna murina duktala celler märkta med en markör, karbanhydras II, skulle kunna ge upphov till alla tre pankreas härstamningar 4. Men med hjälp av andra duktala markörer, såsom HNF1b 5 och Sox9 2 drogs slutsatsen att duktala celler är inte den viktigaste källan till betaceller hos vuxna möss.För flera år sedan föreslog vi att orsaken till den ovannämnda diskussionen kan bero på brist på området 6,7 av lämpliga analytiska verktyg som kan användas för att mäta självförnyelse och flera härstamning differentiering-två kriterier som krävs för att definiera en stamcell. In vivo cre-lox härstamning-spårning teknik nämndaovan kan ge bevis för stamfader-avkomman förhållande på populationsnivå. Emellertid är detta härstamning spåra teknik begränsad i sin makt för att urskilja huruvida enskilda stamceller kan själv förnya och differentiera i flera linjer. Encelliga analys är viktigt eftersom om flera mono-potenta stamceller, var och en med en annan härstamning potential, analyserades tillsammans, kan de kollektivt verkar ha flera härstamning differentiering förmågor. Dessutom stamceller är oftast en mindre population av en vuxen organ. Verksamheten i en mindre cellpopulation kan maskeras av huvudpopulationen. Därför betyder ett negativt resultat från en populationsstudie anger inte nödvändigtvis frånvaro av stamceller. Slutligen innehåller cre-lox härstamning spårning för närvarande inte tillåta mätning av självförnyelse.
Till att börja ta itu med den tekniska klyftan inom bukspottskörteln stamceller biologi, koloni 7-11 eller organoid 12-15 </sup> analyser med hjälp av 3D-odlingssystem utarbetades. Två koloni analyser för bukspottkörteln stamceller har utvecklats i vårt laboratorium: en innehåller en kommersiell beredning av murina extracellulära matrixproteiner (ECM) (se metoder och utrustning tabell), och den andra innehåller laminin hydrogel, en definierad artificiell ECM protein 7-11. Progenitorceller blandas i halvfast medium innehållande metylcellulosa. Metylcellulosa är en biologiskt inert och visköst material framställd från träfibrer och har rutinmässigt använts i hematopoietiska kolonianalyser 16. Metylcellulosa-innehållande halvfast medium begränsar förflyttningen av enkel progenitorceller så att de inte kan re-aggregat. Ännu, är mediet tillräckligt mjuk för att tillåta en stamfadercell att växa och differentiera till en koloni av celler i 3D-rymden. Efter tradition av hematologer, en pankreas stamceller som kunde ge upphov till en koloni av celler var named en pankreatisk kolonibildande enhet (PCFU). PCFUs, när den odlas i den murina ECM-innehållande kolonianalys, ger upphov till cystisk kolonier som benämns "ring" kolonier 7. Vid tillsats av en Wnt-agonist, R-spondin1, i den murina ECM-innehållande odlings vissa ring kolonier förvandlas till "Tät" kolonier 7. I den här artikeln, är dessa två typer av kolonier odlas i murin ECM kultur kollektivt kallade "Ring / Tät" kolonier. När Ring / Täta kolonier dissocierade till en enda cell fjädring och åter pläterad i kulturer som innehåller laminin hydrogel, "Endocrine / Acinar" kolonier bildas 7.
Använda enda koloni analyser, visade det sig att majoriteten av Ring / Täta och endokrina / Acinar kolonier, antingen från vuxna (2-4 månader gamla) 7,11 eller unga (1 vecka gamla) 9 murina bukspottkörteln, uttrycker alla tre härstamningsmarkörer. Detta tyder på att de flesta av de PCFUs ursprung är tri-potenta. I murina ECM-innehållande kolonianalys, vuxen mus PCFUs kraftigt själv förnya och expandera cirka 500.000 gånger under 11 veckor i kultur 7. Murin ECM stöder preferentiellt differentieringen av duktala celler över endokrina och acinära härstamningar, medan i närvaro av laminin hydrogel, är murina PCFUs uppmuntras att differentiera preferentiellt in i endokrina och acinarceller och i mindre utsträckning den duktal härstamning 7,9,11. Viktigt är Insulin + Glukagon – mono-hormonella celler genereras i laminin hydrogel kultur och utsöndrar insulin som svar på glukosstimulering in vitro 7,9, vilket tyder på funktionell mognad. Tri-härstamning differentiering potential 7,9 och självförnyelse 11 enskilda PCFUs bekräftas av encelliga mikromanipulation, det vill säga odling av en cell per brunn för kolonibildning. Tillsammans ger dessa resultat visar att det är självförnyande, tri-potent, faderliknande celler i postnatal mus bukspottkörteln som visar aktiviteter i 3D kultur.
De murina PCFU analyser som beskrivs i denna artikel härrör från en tidigare koloni analys utformad för progenitorceller differentierade från murina embryonala stamceller (mESCs) 17. Detta protokoll dokumenteras i detalj i en annan JUPITER publikation 18. Odlings komponenter och tekniker som krävs för att utföra den murina ECM-innehållande kolonianalys för vuxna PCFUs är desamma som för Mesc-härledda stamceller 17,18. Därför kommer dessa aspekter av analysen inte upprepas här; i stället följande procedurer kommer att tas upp: 1) dissociation av den vuxna bukspottkörteln och sortering CD133 + Sox9 / EGFP + duktala celler, som berikar PCFUs från vuxna möss 7, 2) encelliga manipulation av de sorterade cellerna, 3) enda koloni analyser med hjälp av mikroflödes QRT-PCR och hel-mount immunofärgning, och 4) dissociation av Colonies in encelliga fjädring och åter plätering i murin ECM eller laminin hydrogel kolonianalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bukspottkörtelns kolonianalyser och enda koloni analyser beskrivs här inspirerades av metylcellulosa innehållande hematopoietiska kolonianalyser som har spelat viktiga roller i dechiffrera biologi hematopoetiska progenitorceller under de senaste decennierna 23. I dessa analyser (Figur 5), dissocierade bukspottkörtelceller stryks i metylcellulosa innehållande halvfast media med lämpliga tillväxtfaktorer och ECM-proteiner som stöder bildandet av ring, tät eller endokrina / Acinar kolon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Lucy Brown och Alexander Spalla från Analytical Cytometry Kärna på City of Hope för att få hjälp i sortering. Detta arbete stöds delvis av National Institutes of Health (NIH) ger R01DK081587 och R01DK099734 till HTK och U01DK089533 till ADR, och av National Science Foundation NSF-DMR-1.206.121 och California Institute för regenerativ medicin bidrag RB5-07398 till DAT stöder från Joseph J. Jacobs Institutet för molekylär teknik för medicin vid Caltech till DAT, och de från Oxnard Foundation och Ella Fitzgerald Foundation till HTK är också tacksamma.
Finansiering: Detta arbete stöds delvis av National Institutes of Health (NIH) ger R01DK081587 och R01DK099734 till HTK och U01DK089533 till ADR, och av National Science Foundation NSF-DMR-1.206.121 och California Institute för regenerativ medicin bidrag RB5-07398 till DAT stöder från Joseph J. JacobsInstitutet för molekylär Teknik för medicin vid Caltech till DAT, och de från Oxnard Foundation och Ella Fitzgerald Foundation till HTK är också tacksamma. Research rapporterade i denna publikation ingår arbete som utförs i den analytiska Cytometry Core och ljusmikroskopi Digital Imaging Core stöds av National Cancer Institute i National Institutes of Health i tilldelning nummer P30CA33572.
Studie sponsor: Sponsorn inte delta i studiens utformning, insamling, analys eller tolkning av data.
Materials
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20oC |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20oC | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50mL Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100mmx20mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20oC |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20oC |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20oC |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40um Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 um filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/ Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20oC |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80oC |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80oC |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20oC |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80oC |
| Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) |
Referências
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells–recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
