Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar
Summary
Bu protokol tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için temel usul adımları açıklar. Bu teknik nöronların elektriksel davranışının çalışma sağlar ve beyin dilimleri yapıldığında, hala nispeten iyi korunmuş beyin devreleri entegre edilmiştir nöronlardan farklı nöron işlevlerinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.
Abstract
Tüm hücre yama kelepçe kayıt nöron önemli bir bölümünün elektriksel özelliklerinin çalışma sağlayan bir elektrofizyolojik bir tekniktir. Bu yapılandırmada, mikropipet, daha önce kullanılan hücre içi keskin elektrot kayıt yöntemine göre daha doğru bir iyonik akım ölçümleri mevcut sızmasını önler ve böylece içerir hücre membranı ile sıkı bir temas halindedir. Klasik olarak, tam-hücre kayıt hücre kültürü modelleri, ayrışmış nöronlar, beyin dilimleri nöronlar dahil preparasyonların çeşitli üzere nöronlar üzerinde yapıldı ve sağlam anestezi ya uyanık hayvanlarda edilebilir. Özetle, bu teknik son derece uyarılabilir hücrelerin pasif ve aktif biyofiziksel özelliklerinin anlaşılması için katkıda bulunmuştur. Bu tekniğin önemli bir avantajı da manipülasyonlar (örneğin, farmakolojik, deneyci kaynaklı plastisite) belirli nöronal fonksiyonlar veya c değiştirebilir nasıl özel bilgi sağlamasıdırgerçek zamanlı olarak hannels. Buna ek olarak, plazma zarının önemli bir açıklığı iç pipet çözeltisi serbest sokulması ilaçlar, örneğin, agonistleri veya belirli bir hücre içi proteinlerin antagonistleri için araçlar temin edilmesi ve komşu hücrelerde fonksiyonlarını değiştirmeden bu hedeflerin manipüle, sitoplazma içine nüfuz sağlar. Tam hücreli kayıt üzerinde durulacak Bu makale, beyin dilimleri nöronlar üzerinde bir fizyolojik ilgili bağlamda, yani nispeten iyi korunmuş beyin devreleri, nöronların kayıt avantajı vardır bir hazırlık yapıldı. Özel olarak, uygun bir farmakoloji ile birleştirildiğinde, bu yöntem, öğrenme, ilaç kötüye kullanımı maruz kalma ve stres gibi deneyimler, herhangi bir türü aşağıdaki Meydana gelen neuroadaptations belirlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Özet olarak, beyin dilimleri tam hücre patch-clamp kayıtları ex vivo preparat uzun süreli değişiklikler ölçmek için araç sağlarnöronal işlevleri bu sağlam uyanık hayvanlarda gelişmiştir.
Introduction
Patch-kelepçe tekniği, 1970'lerin sonlarında 1,2 geliştirilmiştir bir elektrofizyolojik teknik canlı dokuda tekli veya çoklu iyon kanal işlevleri çalışmak için birincil araçtır. elde edilebilir, farklı bant konfigürasyonu arasında, bütün hücre patch-clamp kayıtları nöron önemli bir bölümünün, elektrik davranış çalışma sağlar. Klasik olarak, bu teknik, ya in vitro beyin kesitleri, yeni ayrışmış nöronlar üzerinde veya hücre kültürü modelleri 3 gerçekleştirilir. Beyin dilimleri nöronlar üzerinde gerçekleştirilen, bu teknik birçok avantaj sunar. Özellikle: (I) nöronları olduğu bir dereceye kadar nispeten korunmuş beyin devrelerinde kaydedilir ve hücre kültürü preparatlara kıyasla, 3 fizyolojik olarak uygun bir ortam sağlar. Bu, akut Pharmacolog her türlü tarafından tetiklenen hücresel ve moleküler olayları erken yakalayan, hatta gerçek zamanlı olarak izleme veriyornik manipülasyonlar – in vivo koşullarında, klasik kullanılarak elde edilemez bir zamansal çözünürlüğü; görsel beyin dilimleri beyin bölgelerini tespit etmek, (ii) yeteneği, hem de floresan belirteçler zaman beyin bölgesi okudu ve özel nöronlar için yüksek bölgesel özgüllüğü 3 sağlar; (iii) (hücre içi kayıtları için keskin bir mikropipet ile membran delme aksine) plazma zarının önemli bir bölümünü açarak hücrenin hücre içi alana erişim 4. Buna karşılık, bu iç çözüm oluşturan belirli iyonların içeriği veya konsantrasyonu o kadar moleküler hedeflerin değiştirilmesi veya hücresel mekanizmaları farklı koşullar altında ele alınabilir sağlar. Örneğin, tam-hücre konfigürasyonu, herhangi bir farmakolojik madde (örneğin, antagonistler) kurulması sırasında bir kayıt mikropipet (Yama pipet) çözeltisi doğrudan sitoplazma içine nüfuz ve putat hareket edecek ekle kiKomşu hücrelerde hedef fonksiyonu değiştirmeden hücre içi hedefleri ive. Ayrıca, keskin mikropipet kayda göre, yama kelepçe elektrodun ucundaki büyük açılış alt direnci, daha az rekabet halindeki gürültü ve hücrenin 4 içine böylece daha iyi elektrik erişim sağlar. Ancak, pipet ucunda büyük açılış hücre diyaliz yol ve çalışma 5,6 altında biyolojik olayların ifadesi için kritik olabilecek hücre içi moleküler makine, böylece kaybı unutmayın. Bu durumda, sert elektrot kayıtları daha uygun olabilir. Kayıtların Bu tür ve böylece hücre içi alanı ve iç pipet çözeltisi arasında iyon değişiminin çoğu önlenmesi, tüm hücre kayıtları için kullanılan daha küçük olan bir gözenek olan mikropipetler gerektirir.
(Akut veya kronik) deneyimi herhangi bir şekilde dahil olmak üzere kötüye 11,1 ilaçlara, pozlama 7-10 öğrenme2, vb stres 13,14, spesifik beyin bölgelerinde nöronal fonksiyonu çeşitli yönlerini değiştirebilir. Bu değişiklikler genellikle (gün saat) geliştirmek için zaman gerektirdiğinden, belirli bir deneyim geçirmiş hayvanların beyin dilimleri tam hücre kayıtları araştırmacılar bu değişiklikleri tanımlamak için izin verir. Temelde, (hepsi değilse de) nöronal fonksiyonlar (örneğin, ligand-aktive iyon kanalları, voltaj kapılı iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar) ve böylece beyin devre aktivitesi ve davranış, deneyim değiştirilebilir (deneyim bağımlı katılan bileşenler çok plastisite) 10,15-17. Nöronal düzeyde, beyin devresi etkinlik sinaptik arasında sürekli etkileşim (örn glutamat iletim) ve içsel hücresel heyecanlanma faktörleri (örneğin, axosomato-dendritik iyon kanalları çıkar: potasyum, K +, sodyum Na + ve kalsiyum, Ca 2+ ). Whol kullanarak belirli koşullar altındaE-hücre patch-kenetli elektrofizyolojik teknikler, sinaptik genel içsel uyarılabilirliğinin değişikliklerden özellikle kaynaklanan sinyal değişiklik izole edilebilir.
Çoğu durumda, sinaptik uyarılma tüm hücre voltaj-kelepçe tekniği kullanılarak değerlendirilir. Bu kayıt modu α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionic asit reseptörleri tarafından aracılık edilen, örneğin iyon akımlarının [ölçümünü (karşılaştırın AMPA reseptörleri) ve nöronal plazma zarından, N-metil-D-aspartik asit reseptörleri (NMDA reseptörleri)] bir dizi gerilim zar potansiyeli tutarak. Burada, deneyci sezyum ihtiva iç mikropipet çözümleri (Cs +), K + kanallarının geniş bir engelleyici (kilit iç uyarılma faktörler) kullanın. Tüm hücre konfigürasyonunun oluşturulmasından sonra, hücre içi boşlukta Cs + `nin difüzyon K + kanallarını bloke eder ve böylece, nispeten etkin bir alanı kelepçesi ve ön hem de izin verirdiğer ölçümler üzerinde içsel uyarılabilirlik faktörlerin etkisini havalandırın. Düzensiz şekilli hücreler (örneğin, nöronlar) ve 18,19 çardak geniş ve karmaşık dendritik özellikle nöronlar kaydederken Uzay kelepçe sorunları, yani gerilim-kelepçe zorluk tüm hücre, ortaya çıkar. somatik gerilim kelepçe kötü kontroller nöronların dendritik ağacında gerilimi nedeniyle, çalışma kapsamında dendritik elektrik sinyallerine çeşitli yönleri bir dendritik mesafe bağımlı bir şekilde bozulmuş. (Yapay beyin-omurilik sıvısı, ACSF) hücre-dışı çözelti içinde çözüldü bu pikrotoksin (y-aminobütirik asit, GABA A reseptör antagonisti) ya da kynurenic asit (glutamat reseptörlerinin birçok engelleyici) gibi farmakolojik araçlar ile birlikte, bu teknik, glutamat ölçümünü sağlar reseptör ve GABA A sırasıyla akımları R-aracılı.
Buna karşılık, iç uyarılma genellikle akım kelepçe kayıt modunda değerlendirilir.voltaj-kelepçe kayıtları aksine, bu kayıt modu nöronal plazma zarı içinden akan iyon akımlarının neden membran potansiyelleri varyasyonlarının ölçümü. Nöronlar Na + ve K + kanalları gerektiren hem aksiyon potansiyelleri oluşturmak için Tipik olarak, içsel eksitabilite değişiklik yeteneği değişiklikler ile belirlenir. Akım kelepçe kayıtları yaparken, bu nedenle, mikropipetler K + yerine Cs + içeren bir iç çözelti ile doldurulur. Glutamat ve GABA ACSF içinde çözülür A reseptör-aracılı akımları bloke farmakolojik ajanlar ile kombine, bu deney tasarımı sinaptik eksitabilite olası değişiklikleri ile kontamine olmadan nöronal ateşleme içsel faktörler (örneğin, K + kanalları) katkısı ölçülmesini sağlar faktörler.
Bu makale t gerekli temel usul adımları anlatacağızo (i) sağlıklı beyin dilimleri hazırlamak; (Ii) tüm hücre konfigürasyonu elde, ve (iii) sinaptik ve içsel heyecanlanma değerlendirmek için temel parametreleri izlemek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol beyin dilimleri nöronlarda tüm hücre yama-kelepçe deneyler temel işlemi anlatılır. Bununla birlikte, bu tekniğin karmaşık, potansiyel ve hassasiyet tam olarak bu makalede açıklanan edilemez. Burada, en temel adımları tasvir ve başarılı ve titiz bütün hücre kayıtları elde etmek için kontrol edilmelidir önemli parametreleri altını çalıştık. Daha fazla teorik öğrenme, birçok kitap ve makale beyin dilimleri 3,21-24 ve hücre canlılığı geliştirmek amacıyla 25…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma UT Güneybatı başlangıç fonları (SK) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4-H20, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H20, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
Referências
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , (2013).
- Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
- Zhang, W., Linden, D. J. The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).
- Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction. Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).
- Luscher, C., Malenka, R. C. Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling. Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).
- McEwen, B. S., Morrison, J. H. The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course. Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).
- Sandi, C., Haller, J. Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms. Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).
- Kim, S. J., Linden, D. J. Ubiquitous plasticity and memory storage. Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).
- Ganguly, K., Poo, M. M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
- Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. Plasticity of inhibition. Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).
- Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances. J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).
- Defelice, L. J. . Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , (1997).
- Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Kourrich, S., et al. Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine. Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).
- Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward. J Neurosci. , (2012).
- Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens. J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).
- Kourrich, S., Thomas, M. J. Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell. J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity. Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse. Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).
- Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording. Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).
- Novak, P., et al. Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels. Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).
