Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile
Summary
Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Abstract
Exosome Forschung in den letzten drei Jahren hat sich stark den Umfang einen Beitrag zur Identifizierung und Charakterisierung von Biomarkern und deren therapeutische Verwendungen ausgeweitet.
Exosomen sind microRNAs (miRs) gezeigt enthalten kürzlich. Mirs haben sich als wertvolle Biomarker für diagnostische Zwecke entstanden sind. Als Probenentnahme in Kliniken und Krankenhäusern sehr unterschiedlich ist, variiert miRNA-Isolierung aus Voll Galle erheblich. Um das zu erreichen robuste, genaue und reproduzierbare miRNA Profile gesammelt Gallenproben auf einfache Weise erforderte die Entwicklung eines qualitativ hochwertigen Protokoll zu isolieren und Exosomen von Galle zu charakterisieren. Das Verfahren erfordert mehrere Zentrifugationen und einen Filtrationsschritt mit einer abschließenden Ultrazentrifugationsschritt die isolierten Exosomen zu pelletieren. Elektronenmikroskopie, Western-Blots, Durchflusszytometrie und Multi-Parameter-Nanopartikel-optische Analyse, soweit verfügbar, sind von entscheidender Bedeutung Charakterisierung Schritte, um die Qualität der E zu validierenxosomes. Für die Isolierung von miRNA aus diesen Exosomen, das Lysat mit einem unspezifischen, synthetische miRNA aus einer Spezies , wie Caenorhabditis elegans Spiking, das heißt, Cel-miR-39 , ist wichtig für die Normierung der RNA – Extraktionseffizienz. Die Isolierung von Exosomen von Gallenflüssigkeit nach dieser Methode ermöglicht die erfolgreiche miRNA Profilierungs von Gallenproben für mehrere Jahre bei -80 ° C gelagert.
Introduction
Wie bei anderen biologischen Flüssigkeiten, also der Muttermilch, Plasma oder Urin, Galle enthält Exosomen, lipidreiche Vesikeln 1-4. Exosomen können biologische Funktionen in Empfängerzellen 5, 6, eine Form von Zell-Zell – Kommunikation induzieren oder zu verändern , die 4, Teil ihrer normalen Funktion 7-9 sein könnten. Exosomen können miRNA – Arten enthalten , die 10 eine wertvolle Quelle für Biomarker für die Diagnose zur Verfügung stellen kann. miRNAs Profile haben beträchtliche Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als diagnostisches und prognostischen Marker für eine Vielzahl von Krankheiten 11-14 gewonnen.
miRNA selbst kann in biologischen Flüssigkeiten, möglicherweise veröffentlicht von toten Zellen und die Menge der Schuppen Zellen gefunden werden kann, stark von einer zugrundeliegenden Krankheit beeinflusst werden. Die miRNA Profil von Exosomen geben nicht unbedingt die miRNA Profil der Ursprungszelle 6, 10, 15-17, noch Exosomen können miRNA Unterschriften tragen, die für die elterliche ce charakteristisch sein könntell eine Tumorzelle mögen. Tumor-abgeleitete Exosomen wurden im Plasma von Patienten mit Lungenadenokarzinom, Prostatakrebs und anderen Tumoren 8, 16, 18 identifiziert.
Das Ziel dieser Methode ist die zuverlässige und robuste Isolierung der Exosomen aus menschlichen Gallenproben, weitgehend unabhängig von ihrer vorherigen Handhabungsverfahren. Es wurde Galle als eine zuverlässige Quelle von miRNA für die mögliche Diagnose von Erkrankungen des Gallengangs wie Cholangiokarzinom 19 zu verwenden , entwickelt. Es besteht aus mehreren Schritten Zentrifugation mit zunehmender Geschwindigkeit Exosomen zu isolieren und möglicherweise zu anderen biologischen Flüssigkeiten anwendbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um zuverlässig Exosomen isoliert von Galle nutzen, ist es wichtig, eine gleichbleibend hohe Qualität Isolierungsverfahren zu verwenden, um qualitativ hochwertige Proben im Gegenzug erhalten. Die Methodik in diesem Dokument definiert ist, eine gut etablierte Weg Exosomen und miRNA aus menschlichen Galle zu isolieren. Sie weist auf mehrere entscheidende Schritte bei der Charakterisierung der isolierten Exosomen, die bei einem Minimum sollte Elektronenmikroskopie oder Nanopartikel optische Analyse und Western-Blots umfas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
Materials
| 0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
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