अलगाव और की रूपरेखा MicroRNA युक्त मानव पित्त से Exosomes
Summary
Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Abstract
पिछले तीन वर्षों में Exosome अनुसंधान बहुत पहचान और बायोमार्कर और उनके चिकित्सीय उपयोगों के लक्षण वर्णन की ओर गुंजाइश बढ़ा दिया गया है।
Exosomes हाल ही में microRNAs (Mirs) को रोकने के लिए दिखाया गया है। Mirs खुद को नैदानिक प्रयोजनों के लिए बहुमूल्य बायोमार्कर के रूप में पैदा हुई है। क्लीनिक और अस्पतालों में नमूना संग्रह काफी चर रहा है के रूप में, पूरे पित्त से miRNA अलगाव काफी भिन्न होता है। एक सरल तरीके से एकत्र नमूनों से पित्त, मजबूत सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य miRNA प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए अलग और पित्त से exosomes चिह्नित करने के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटोकॉल के विकास की आवश्यकता है। विधि कई centrifugations और पृथक exosomes गोली के लिए एक अंतिम ultracentrifugation कदम के साथ एक निस्पंदन कदम की आवश्यकता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, पश्चिमी blots, प्रवाह cytometry और मल्टी पैरामीटर nanoparticle ऑप्टिकल विश्लेषण, जहां पर उपलब्ध ई की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं लक्षण वर्णनxosomes। इन exosomes से miRNA के अलगाव, Caenorhabditis एलिगेंस, यानी की तरह एक प्रजाति से एक गैर विशिष्ट, सिंथेटिक miRNA साथ lysate spiking के लिए, Cel-मीर 39, शाही सेना निकासी दक्षता को सामान्य बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। पित्त द्रव इस विधि के बाद से exosome के अलगाव के सफल miRNA -80 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों के लिए संग्रहीत पित्त नमूनों से की रूपरेखा की अनुमति देता है।
Introduction
अन्य जैविक तरल पदार्थ, यानी, मां के दूध, चाय या मूत्र की तरह, पित्त exosomes, लिपिड अमीर पुटिकाओं 1-4 शामिल हैं। Exosomes प्रेरित या प्राप्तकर्ता कोशिकाओं 5, 6, कि अपने सामान्य कार्य 4, 7-9 का हिस्सा हो सकता सेल सेल संचार का एक रूप में जैविक कार्यों को बदल सकते हैं। Exosomes miRNA प्रजातियों जो निदान के लिए 10 बायोमार्कर का एक महत्वपूर्ण स्रोत प्रदान कर सकते हैं शामिल कर सकते हैं। miRNAs प्रोफाइल रोगों 11-14 की एक किस्म के लिए नैदानिक और शकुन मार्कर के रूप में हाल के वर्षों में काफी ध्यान प्राप्त की है।
miRNA में ही जैविक तरल पदार्थ, संभवतः मृत कोशिकाओं द्वारा जारी की है और शेड कोशिकाओं की मात्रा बहुत एक अंतर्निहित रोग से प्रभावित किया जा सकता है में पाया जा सकता है। Exosomes की miRNA प्रोफ़ाइल जरूरी प्रारंभिक सेल 6, 10, 15-17 से miRNA प्रोफ़ाइल को प्रतिबिंबित नहीं करता है, फिर भी exosomes miRNA हस्ताक्षर है कि माता पिता का सीई के लिए विशेषता हो सकता है ले सकते हैंएक ट्यूमर सेल की तरह होगा। ट्यूमर व्युत्पन्न exosomes फेफड़ों adenocarcinoma, प्रोस्टेट कैंसर और अन्य ट्यूमर 8, 16, 18 के साथ रोगियों के प्लाज्मा में पहचान की गई है।
इस पद्धति का लक्ष्य मानव पित्त नमूनों, उनके पूर्व हैंडलिंग प्रक्रियाओं का काफी हद तक स्वतंत्र से exosomes के विश्वसनीय और मजबूत अलगाव है। यह इस तरह के cholangiocarcinoma 19 के रूप में पित्त नली के रोगों के निदान के लिए संभावित miRNA का एक विश्वसनीय स्रोत के रूप में पित्त का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया था। यह बढ़ती गति exosomes को अलग करने के साथ centrifugation के कई कदम से मिलकर बनता है और अन्य जैविक तरल पदार्थ के लिए लागू हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मज़बूती से पित्त से अलग exosomes का उपयोग करने के लिए, यह बदले में उच्च गुणवत्ता के नमूने प्राप्त करने के लिए लगातार उच्च गुणवत्ता अलगाव के तरीकों को रोजगार के लिए महत्वपूर्ण है। कार्यप्रणाली इस पत्र में पर?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
Materials
| 0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
Referências
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
