İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar
Summary
Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Abstract
son üç yılda exosome araştırma büyük ölçüde biyomarkerların ve bunların terapötik kullanımları tanımlanması ve karakterizasyonu doğru kapsamını genişletmiştir.
Eksozomlar en son microRNA (MIRS) içerdiği gösterilmiştir. MIRS kendileri tanısal amaçlı değerli biyomarkerların olarak ortaya çıkmıştır. klinik ve hastanelerde numune toplama oldukça değişken olduğundan, tüm safra gelen miRNA izolasyon önemli ölçüde değişir. basit bir şekilde toplanan safra örnekleri, sağlam, güvenilir ve tekrar MiRNA profilleri elde etmek için izole etmek ve safradan eksozomlar karakterize etmek için yüksek kaliteli bir protokolünün geliştirilmesi gerekmektedir. yöntem, birkaç santrüfüj ve izole eksozomlar pelet nihai ultrasantrifügasyon adım bir filtre etme adımı gerektirir. Elektron mikroskobu, Western blot, flow sitometri ve çok parametreli nanoparçacık optik analiz, mevcut, e kalitesini doğrulamak için çok önemli karakterizasyon adımlardırxosomes. Örneğin Caenorhabditis elegans gibi bir türden gelen bir spesifik olmayan sentetik miRNA'nın ile lisat spike bu eksozom Mirna izolasyonu için, Cel-miR-39, RNA ekstraksiyon verimi normalleştirilmesi için önemlidir. Bu yöntem aşağıdaki safra sıvısından eksozom izolasyonu başarılı MiRNA -80 ° C'de birkaç yıl boyunca saklanabilir safra örnekleri profil sağlar.
Introduction
Diğer biyolojik yani sıvıların, anne sütü, plazma veya idrar gibi, safra ekzozomlar, lipit zengin veziküller 1-4 içerir. Eksozomlar neden veya alıcı hücreler 5, 6, normal fonksiyon 4, 7-9 bir parçası olabilir, hücre-hücre iletişiminin bir biçimde biyolojik fonksiyonları değiştirebilir. Eksozomlar tanı 10 biyomarkerların değerli bir kaynak sağlayabilir miRNA türlerini içerebilir. miRNA'lar profilleri hastalıkların 11-14 çeşitli tanısal ve prognostik belirteç olarak son yıllarda önemli önem kazanmıştır.
miRNA kendisi biyolojik sıvılarda, muhtemelen ölü hücrelerden salınan ve döken hücrelerin miktarı büyük ölçüde altta yatan hastalığa etkilemiş olabilir bulunabilir. Eksozom miRNA profili mutlaka kaynak hücresine 6, 10, 15-17 miRNA profili yansıtmaz, henüz ekzozomlar ebeveyn ce için karakteristik olabilir miRNA imzaları taşıyabilirBir tümör hücresi gibi olacağım. Tümör kaynaklı eksozomlar, akciğer adenokarsinom, prostat kanseri ve diğer tümörlerin 8, 16, 18 olan hastaların plazmasında belirlenmiştir.
Bu yöntemin amacı, onların önceki kullanım prosedürleri büyük ölçüde bağımsız insan safra örneklerinden gelen eksozomlann güvenilir ve sağlam izolasyon olduğunu. Böyle kolanjiokarsinomlar 19 olarak safra kanalının hastalıkların potansiyel tanısı için miRNA güvenilir bir kaynak olarak safra kullanmak için geliştirilmiştir. Bu eksozomlar izole etmek hızları artan santrifüj birkaç aşamadan oluşmaktadır ve diğer biyolojik sıvılarda uygulanabilir olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
güvenilir safra izole eksozomlar yararlanmak için, karşılığında yüksek kaliteli örnekleri elde etmek için tutarlı, yüksek kaliteli izolasyon yöntemleri kullanılması önemlidir. Bu yazıda tanımlanan metodoloji, insan safra gelen eksozomlar ve miRNA izole etmek köklü bir yoldur. Bu en azından elektron mikroskobu ya da nanoparçacık optik analiz ve Western lekeleri içermelidir izole Eksozomlann karakterizasyonu birkaç önemli adımlar vurgulamaktadır.
o miRNA istikrar ge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
Materials
| 0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
Referências
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
