Expression et purification de particules de virus-like pour la vaccination
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la synthèse de particules de type viral en utilisant soit baculovirus ou systèmes d'expression de mammifères, et la purification de l'ultracentrifugation. Cette approche hautement personnalisable est utilisée pour identifier des antigènes viraux comme cibles de vaccins d'une manière sûre et flexible.
Abstract
Les particules virales (VLP) et des particules sous-virales (de SSVP) sont une approche alternative à la conception de vaccins viraux qui offre les avantages de l'augmentation de la biosécurité et de la stabilité sur l'utilisation d'agents pathogènes vivants. Non-infectieuses et auto-assemblage, les VLP sont utilisés pour présenter les protéines structurales comme immunogènes, en contournant la nécessité d'agents pathogènes vivants ou des vecteurs viraux recombinants pour la livraison de l'antigène. Dans cet article, nous démontrons les différentes étapes de la conception et le développement VLP pour des applications futures dans l'expérimentation animale préclinique. La procédure comprend les étapes suivantes: la sélection de l'antigène, l'expression de l'antigène dans la lignée cellulaire de choix, la purification des VLP / des SVP, et la quantification de l'antigène dosage. Nous démontrons l'utilisation des deux lignées cellulaires de mammifères et d'insectes pour l'expression de nos antigènes et de démontrer comment les méthodologies diffèrent du rendement. La méthodologie présentée peut demander à une variété d'agents pathogènes et peut être obtenue en substituant les antigènes avec str immunogèneuctural protéines de la micro-organisme de l'utilisateur d'intérêt. VLP et aider avec l'antigène des SVP caractérisation et sélection des meilleurs candidats vaccins.
Introduction
Les particules virales (VLP) sont une technologie approuvée pour la vaccination humaine. En fait, certains des vaccins plus contemporarily sous licence, y compris le virus du papillome humain (VPH) et l'hépatite Β (HepΒ) vaccins utilisent cette approche. Les VLP sont formées à partir des protéines structurales capables d'auto-assemblage. Les particules assemblées imitent morphologies virales, mais ne peuvent pas infecter ou de reproduire parce qu'ils manquent de génomes viraux. Les VLP peuvent être exprimés et purifiés à partir d'un certain nombre de systèmes procaryotes et eucaryotes. Une revue de la littérature a révélé que différents systèmes d'expression sont employés aux taux suivants: bactéries – 28%, de la levure – 20%, plante – 9%, insecte – 28%, et de mammifères – 15% 1. Il faut noter que les vaccins HPV à base de protéine de capside L1 sont produites dans la levure (Gardasil) ou dans un système de cellules d'insecte (Cervarix) 2. Vaccins HepΒ, Recombivax et Engerix-Β, sont également produites dans la levure, et sont composés de HepΒ antigène de surface 3, 4.
Nous utilisons des systèmes d'expression de cellules d'insectes et de mammifères pour produire des VLP nécessitant une co-expression de plusieurs protéines structurales pour l'assemblage. Notre travail se concentre sur la conception, la production et les vaccins à base de VLP-purifiantes contre les agents pathogènes humains: virus de la grippe, le virus respiratoire syncytial (RSV), le virus de la dengue (DENV), et le virus du chikungunya (CHIKV). Nos méthodes sont suffisamment souples pour permettre la co-expression des protéines structurales multiples à partir de plusieurs plasmides d'expression ou un plasmide d'expression (figure 1). Auparavant, nous avons produit et purifié H5N1 VLP assemblé à partir de la co-expression de plasmides codant pour la grippe hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA), et de la matrice (M1) dans des cellules de rein embryonnaire humain 293T 5,6. Les gènes ont été codons optimisés pour l'expression dans des cellules de mammifères et clones dans pTR600, un vecteur d'expression eucaryote contenant le cytomégalovirus promoteur immédiat-précoce, plus Intron A pour initier transcription d'inserts eucaryotes et le signal de polyadénylation de l' hormone de croissance bovine pour la terminaison de la transcription 7. Une approche similaire en utilisant la co-expression de trois plasmides de HA, NA (figure 1A) et une protéine de matrice du virus de remplacement, le VIH Gag p55, a été utilisé pour la production du sous – type de grippe humaine saisonnière H3N2 VLP dans cette étude et a été montré pour générer VLP de taille similaire à celle des particules de la grippe 8. Bien que les vaccins contre la grippe provoquent principalement des anticorps anti-HA, l'addition de neuraminidase de la grippe médie l' activité de la sialidase pour permettre le bourgeonnement des VLP à partir des cellules transfectées et 9 présentent également des cibles immunogènes supplémentaires. RSV pour produire des VLP, nous avons choisi le noyau non lié du VIH Gag pour concevoir des vaccins prototypes qui présentent des glycoprotéines de surface RSV exclusivement pour démontrer davantage la flexibilité de la formation de VLP en utilisant Gag du VIH, comme décrit précédemment et caractérisé par microscopie électronique à 6,10. Autresont précédemment montré que les VLP présentant glycoprotéines de RSV peuvent être assemblés en utilisant différents composants viraux du virus de la maladie de Newcastle (NDV) 11 et la matrice 12 de la grippe. Pleine longueur surface des séquences de glycoprotéine ont été utilisées dans cette étude pour conserver des conformations natives qui peuvent être nécessaires pour le récepteur fonctionnel de liaison et le dosage de reconnaissance d'anticorps par dosage immuno-enzymatique (ELISA).
Nos exemples d'utilisation de systèmes d'expression de plasmides individuels pour générer des particules sont MENV et CHIKV. Dans le cas de DENV, nous pouvons produire des particules sous – virales (de SSVP) sans capside dans des cellules 293T à partir d' un seul plasmide contenant un prM / E gène de structure cassette d' expression 13. Le terme SVP est utilisé pour désigner l'absence d'une protéine de noyau ou capside dans l'assemblage des protéines structurales virales. CHIK VLP peut également être produite en utilisant un seul plasmide contenant une cassette CHIKV gène de structure codant pour les protéines de capside et d'enveloppe, ou insect cellules par infection avec un baculovirus recombinant codant pour la même cassette de gène structural optimisé pour l' expression de cellules d' insecte (figure 1B – C).
Le résultat de l'expression approches discutées ci-dessus final est la libération de VLP dans le milieu de culture cellulaire qui peut ensuite être purifié par une ultracentrifugation à travers un coussin de glycerol à 20%. Dans ce rapport, nous présentons les méthodes pour exprimer et purifier ces VLP à partir de systèmes cellulaires de mammifères et d'insectes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons utilisé les techniques décrites ci-dessus pour exprimer et purifier avec succès et les VLP composées des SVP de protéines structurales multiples pour différents agents pathogènes. En général, nous utilisons des systèmes d'expression de mammifères pour générer nos VLP. Cependant, dans nos mains, de cellules de mammifères dérivé CHIK rendements VLP étaient faibles. rendement VLP CHIK était plus robuste lors de l'utilisation Un système de cellules baculovirus-insecte recombinant. En g?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres antérieurs du laboratoire Ross qui ont permis d'optimiser le protocole pour l'efficacité et le rendement maximal.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Referências
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