Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.
Abstract
Virus-ähnliche Partikel (VLPs) und subvirale Partikel (SVPs) sind ein alternativer Ansatz zu viraler Impfstoff-Design, das die Vorteile der erhöhten biologischen Sicherheit und Stabilität gegenüber der Verwendung von lebenden Pathogenen bietet. Nicht-infektiös und selbstorganisierenden, VLPs werden verwendet, Strukturproteine als Immunogene darzustellen, wodurch die Notwendigkeit für lebende Pathogene oder rekombinanter viraler Vektoren für die Antigenabgabe umgehen. In diesem Artikel zeigen wir die verschiedenen Stadien der VLP-Design und Entwicklung für zukünftige Anwendungen in der präklinischen Tierversuche. Das Verfahren umfasst die folgenden Phasen: Auswahl des Antigens, die Expression von Antigen in Zelllinie der Wahl, Reinigung von VLPs / SVP und Quantifizierung für Antigen Dosierung. Wir demonstrieren den Einsatz beider Säugetier- und Insektenzelllinien zur Expression unserer Antigene und zeigen, wie Methoden der Ausbeute unterscheiden. Die Methodik dargestellt kann auf eine Vielzahl von Pathogenen anwendbar und kann durch Einsetzen der Antigene mit immunogenen str erreicht werdenuctural Proteine des Mikroorganismus von Interesse des Benutzers. VLPs und SVP unterstützen mit Antigen Charakterisierung und Auswahl der besten Impfstoffkandidaten.
Introduction
Virus-ähnliche Partikel (VLPs) sind eine bewährte Technologie für die menschliche Impfung. In der Tat beschäftigen einige der contemporarily zugelassene Impfstoffe, einschließlich der humanen Papillomviren (HPV) und Hepatitis Β (HepΒ) Impfstoffe diesen Ansatz. VLPs sind in der Lage die Selbstorganisation von Strukturproteinen gebildet. Die zusammengesetzten Teilchen nachahmen viral Morphologien, kann aber nicht infizieren oder zu replizieren, weil sie viralen Genomen fehlt. VLPs können aus einer Reihe von prokaryotischen und eukaryotischen Systemen exprimiert und gereinigt werden. Eine Überprüfung der Literatur ergab , dass unterschiedliche Expressionssysteme mit den folgenden Raten eingesetzt werden: Bakterien – 28%, Hefe – 20%, Pflanzen – 9%, Insekten – 28%, und Säuger – 15% 1. Zu beachten ist , Protein – Impfstoffe HPV basierend auf L1 – Kapsid in Hefe (Gardasil) oder in einer Insektenzellsystem (Cervarix) 2 hergestellt. HepΒ Impfstoffe, Recombivax und Engerix-Β, werden auch in Hefe hergestellt und bestehen aus HepΒ Oberflächenantigen 3, 4.
Wir verwenden Säuger- und Insektenzellexpressionssysteme VLPs herzustellen erfordern Coexpression von mehreren Strukturproteinen für die Montage. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Gestaltung, Herstellung und Reinigung von VLP-basierte Impfstoffe gegen humanpathogene Erreger: Influenza-Virus, Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), Dengue-Virus (DENV) und Chikungunya-Virus (CHIKV). Unsere Verfahren sind flexibel genug , um die Coexpression der mehreren Strukturproteinen aus mehreren Expressionsplasmiden oder einem einzigen Expressionsplasmid (Figur 1) zu ermöglichen. Zuvor produzierten wir und gereinigter H5N1 VLPs zusammengesetzt aus der Co-Expression von Plasmiden codiert , Influenza – Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrix (M1) in humane embryonale Nierenzellen 293T 5,6. Die Gene wurden für die Expression in Säugerzellen-Kodon-optimierten und kloniert in pTR600, einem eukaryotischen Expressionsvektor, der Cytomegalovirus-immediate-early-Promotor und Intron A zum Initiieren umschrift enthaltendription von eukaryotischen Einsätze und das Rinderwachstumshormon – Polyadenylierungssignal für die Beendigung der Transkription 7. Ein ähnlicher Ansatz der drei Plasmid Co-Expression von HA, NA (1A) und eine alternative virale Matrix – Protein, HIV Gag p55, wurde unter Verwendung von für die Erzeugung von menschlichen saisonalen Influenza – Subtyp H3N2 VLPs in dieser Studie verwendet und wurde zu generieren gezeigt VLPs von ähnlicher Größe wie Influenza Partikel 8. Obwohl überwiegend Influenza – Impfstoffe Anti-HA – Antikörper hervorzurufen, vermittelt die Zugabe von Influenza – Neuraminidase Sialidaseaktivität VLP zu ermöglichen , von transfizierten Zellen 9 und auch vorhanden zusätzliche immunogene Ziele Knospung. Um RSV VLPs herzustellen, wählten wir auch die in keinem Zusammenhang Kern von HIV – Gag zu prototypische Impfstoffe entwickeln , die weiter ausschließlich RSV Oberfläche Glykoproteine präsentieren Flexibilität der VLP – Bildung zeigen , unter Verwendung von HIV – Gag, wie zuvor durch Elektronenmikroskopie 6,10 beschrieben und charakterisiert. AndereVerwendung zusammengebaut werden verschiedene virale Komponenten von Newcastle Disease Virus (NDV) 11, und Influenza – Matrix 12 , dass VLPs präsentiert RSV – Glykoproteine können zuvor gezeigt haben. Voller Länge Oberfläche Glykoprotein-Sequenzen wurden in dieser Studie verwendet, um nativen Konformationen behalten, die für funktionelle Rezeptorbindung und Antikörper-Erkennungs Assay durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) notwendig sein kann.
Unsere Beispiele für die Verwendung von einzelnen Plasmid-Expressionssysteme Partikel sind DENV und CHIKV zu erzeugen. Im Falle von DENV können wir subvirale Partikel (SVPs) ohne Kapsid in 293T – Zellen aus einem einzelnen Plasmid , das ein prM / E – Strukturgens Expressionskassette enthält 13 herzustellen. Der Begriff SVP wird verwendet, um das Fehlen eines Kerns oder Kapsidprotein in der Montage von viralen Strukturproteine zu bezeichnen. CHIK VLPs können auch ein einzelnes Plasmid, das ein CHIKV strukturelle Gen-Kassette, die Codierung Kapsid und Hüllproteine gewonnen werden, enthält, oder in insect Zellen mit einem rekombinanten Baculovirus codiert , die gleiche strukturelle Genkassette optimiert für Insektenzellexpressions (1B – C) zu infizieren.
Das Endergebnis des Ausdrucks oben diskutierten Ansätze ist die Freisetzung von VLPs in den Zellkulturmedium, das dann über Ultrazentrifugation durch einen 20% Glycerin Kissen leicht gereinigt werden. In diesem Bericht stellen wir Methoden, um diese VLPs aus Säugetier- und Insektenzellsysteme, zum Ausdruck zu bringen und zu reinigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben die Techniken, die oben beschrieben erfolgreich verwendet, um auszudrücken und zu reinigen, SVP und VLPs aus mehreren Strukturproteine für verschiedene Krankheitserreger. In der Regel verwenden wir Säugetier-Expressionssysteme unserer VLPs zu erzeugen. in unseren Händen, abgeleitet Säugetier-Zelle jedoch CHIK VLP Ausbeuten waren gering. CHIK VLP Ausbeute war robuster, wenn ein rekombinantes Baculovirus-Insektenzellsystem. Im allgemeinen Baculovirus-Insektenzellsysteme, ergeben höhere Mengen an reko…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir wünschen den Stand der Mitglieder des Ross-Labor zu erkennen, die das Protokoll für maximale Effizienz und die Erträge zu optimieren geholfen haben.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Referências
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