Espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per la sintesi di particelle virus-simili che utilizzano sia baculovirus o sistemi di espressione di mammifero, e la purificazione ultracentrifugazione. Questo approccio altamente personalizzabile viene utilizzato per identificare antigeni virali come bersagli vaccino in modo sicuro e flessibile.
Abstract
particelle virus-simili (VLP) e particelle subvirale (SVP) sono un approccio alternativo per la progettazione di vaccini virali che offre i vantaggi di una maggiore sicurezza biologica e stabilità oltre l'uso di agenti patogeni dal vivo. Non infettive e di auto-assemblaggio, VLP sono utilizzati per presentare proteine strutturali come immunogeni, bypassando la necessità di agenti patogeni dal vivo o vettori virali ricombinanti per la consegna antigene. In questo articolo, abbiamo dimostrato le diverse fasi di progettazione VLP e sviluppo per applicazioni future in sperimentazione animale preclinico. Il procedimento comprende le seguenti fasi: selezione di antigene, espressione dell'antigene in linea cellulare di scelta, purificazione di VLP / SVP, e quantificazione per il dosaggio dell'antigene. Dimostriamo uso di entrambe le linee cellulari di mammiferi e insetti per l'espressione dei nostri antigeni e dimostrare come le metodologie differiscono nella resa. La metodologia presentata può applicare a una varietà di agenti patogeni e può essere ottenuto sostituendo gli antigeni con str immunogenicoproteine uctural di microrganismo dell'utente di interesse. VLP e SVP assistono con caratterizzazione dell'antigene e la selezione dei migliori candidati vaccini.
Introduction
particelle virus-simili (VLP) sono una tecnologia approvata per la vaccinazione umana. In effetti, alcuni dei vaccini più contemporaneamente in licenza, tra cui il papillomavirus umano (HPV) e l'epatite Β (HepΒ) vaccini impiegano questo metodo. VLP sono formate da proteine strutturali in grado di auto-assemblaggio. Le particelle assemblate imitano morfologie virali, ma non possono infettare o replicare perché non hanno genomi virali. VLP possono essere espressi e purificati da un certo numero di sistemi procariotici ed eucariotici. Una revisione della letteratura ha rivelato che diversi sistemi di espressione sono impiegati alle seguenti tariffe: batteri – 28%, lievito di birra – 20%, impianto – 9%, insetto – 28%, e di mammiferi – 15% 1. Da segnalare, vaccini HPV a base di proteine del capside L1 sono prodotte nel lievito (Gardasil) o in un sistema di cellule di insetto (Cervarix) 2. Vaccini HepΒ, Recombivax e Engerix-Β, sono prodotti anche nel lievito, e sono composti da HepΒ antigene di superficie 3, 4.
Usiamo sistemi di espressione di cellule di mammiferi e insetti per la produzione di VLP che richiedono co-espressione di molteplici proteine strutturali per il montaggio. Il nostro lavoro si concentra sulla progettazione, produzione, e di vaccini VLP-based di depurazione contro gli agenti patogeni umani: virus dell'influenza, virus respiratorio sinciziale (RSV), virus della dengue (DENV), e virus Chikungunya (CHIKV). I nostri metodi sono sufficientemente flessibili per permettere co-espressione delle molteplici proteine strutturali da più plasmidi di espressione, o un singolo plasmide di espressione (Figura 1). In precedenza, abbiamo prodotto e purificato H5N1 VLP assemblato dalla co-espressione di plasmidi che codificano emoagglutinina influenza (HA), neuraminidasi (NA), e matrice (M1) in embrionali cellule 293T renali umane 5,6. I geni sono stati codone-ottimizzati per l'espressione in cellule di mammifero e clonati in pTR600, un vettore di espressione eucariotica contenente i citomegalovirus immediato inizio promotore più INTRON A per avviare transcrizione di inserti eucariotiche e il segnale di poliadenilazione ormone della crescita bovina per la terminazione della trascrizione 7. Un approccio simile utilizzando tre plasmide co-espressione di HA, NA (Figura 1A) e una proteina della matrice virale alternativa, HIV Gag p55, è stato utilizzato per la generazione di influenza stagionale sottotipo umana H3N2 VLP in questo studio e ha dimostrato di generare VLP di dimensioni simili come particelle influenzali 8. Anche se vaccini contro l'influenza prevalentemente suscitano anticorpi anti-HA, l'aggiunta di neuraminidasi dell'influenza media attività sialidasi per consentire VLP in erba da cellule trasfettate 9 e presenti anche gli obiettivi immunogenico aggiuntivi. Per produrre RSV VLP, abbiamo anche scelto il nucleo non collegato di HIV Gag per progettare vaccini prototipo che presentano glicoproteine di superficie esclusivamente RSV per dimostrare ulteriormente la flessibilità della formazione VLP con HIV Gag, come descritto in precedenza e caratterizzato da microscopia elettronica 6,10. Altrihanno precedentemente dimostrato che VLP presentando glicoproteine RSV possono essere assemblati utilizzando vari componenti virali da virus della malattia di Newcastle (NDV) 11, e l'influenza di matrice 12. Full-length sequenze glicoproteina di superficie sono stati utilizzati in questo studio per mantenere conformazioni nativi che possono essere necessari per il recettore funzionale di legame e il dosaggio degli anticorpi riconoscimento attraverso test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
I nostri esempi di utilizzo di sistemi di singola espressione plasmide per generare particelle sono DENV e CHIKV. Nel caso di DENV, possiamo produrre particelle subvirale (SVP) senza capside in cellule 293T da un singolo plasmide contenente un PRM / E gene strutturale cassetta di espressione 13. Il termine SVP viene usato per indicare la mancanza di una proteina core o capside nell'assemblaggio di proteine strutturali virali. CHIK VLP può anche essere prodotto utilizzando un singolo plasmide contenente un CHIKV cassette gene strutturale, capside codifica e busta proteine, o in icellule nsect infettando con un baculovirus ricombinante che codifica per la stessa cassetta gene strutturale ottimizzato per l'espressione di cellule di insetto (Figura 1B – C).
Il risultato finale dell'espressione approcci sopra discusso è il rilascio di VLP nel mezzo di coltura cellulare che possono poi essere purificato mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino glicerolo 20%. In questo rapporto, presentiamo i metodi per esprimere e purificare queste VLP da sistemi cellulari di mammiferi e insetti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo usato le tecniche sopra descritte per esprimere con successo e purificare SVP e VLP composti da più proteine strutturali di vari agenti patogeni. In generale, usiamo sistemi di espressione di mammifero per generare i nostri VLP. Tuttavia, nelle nostre mani, dei mammiferi cellule derivate Chik rendimenti VLP erano bassi. CHIK resa VLP è stato più robusto quando si utilizza un sistema di celle baculovirus-insetto ricombinante. In generale, baculovirus-insetti sistemi cellulari producono una maggiore quant…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vogliamo riconoscere i membri precedenti del laboratorio Ross che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo per la massima efficienza e rendimento.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Referências
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