ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製
Summary
ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。
Abstract
ウイルス様粒子（VLP）およびサブウイルス粒子（のSVP）は、ライブ病原体の使用よりも増加した生物学的安全性と安定性の利点を提供するウイルスワクチン設計の代替的なアプローチです。非感染性および自己集合、VLPは、ライブの病原体または抗原の送達のための組換えウイルスベクターの必要性を迂回し、免疫原としての構造タンパク質を提示するために使用されます。この記事では、前臨床動物試験で将来のアプリケーションのためのVLPの設計と開発のさまざまな段階を示しています。抗原の選択、選択、VLPを/のSVPの精製、および抗原投与のための定量化の細胞株における抗原の発現：手順は、以下の段階を含んでいます。私たちは、抗原の発現のための両方の哺乳動物および昆虫細胞株の使用を実証し、方法論は収量が異なる方法を示しています。提示された方法論は、様々な病原体に適用することができるし、免疫原性STRで抗原を置換することによって達成することができます興味のあるユーザーの微生物のucturalタンパク質。 VLPおよびのSVPは最高のワクチン候補の抗原の特徴付けおよび選択を支援します。
Introduction
ウイルス様粒子（VLP）は、ヒトのワクチン接種のために承認された技術です。実際には、ヒトパピローマウイルス（HPV）を含む多くの現代的なライセンスワクチンの一部及び肝炎Β（HepΒ）ワクチンは、このアプローチを採用します。 VLPは自己集合することが可能な構造タンパク質から形成されます。組み立てられた粒子は、ウイルスの形態を模倣するが、彼らはウイルスゲノムを欠くので感染または複製することはできません。 VLPは、発現され、原核生物および真核生物系の数から精製することができます。 – 28％、酵母- 20％、植物- 9％、昆虫- 28％、および哺乳動物- 15％1細菌：文献のレビューは、異なった発現系は、以下のレートで使用されていることを明らかにしました。注目すべきは、L1カプシドタンパク質に基づくHPVワクチンは、酵母（ガーダシル）または昆虫細胞システム（サーバリックス）2で製造されます。 HepΒワクチン、RecombivaxとENGERIX-Βは、また、酵母で生産されており、HepΒ表面抗原3で構成されています、4。
我々は、アセンブリのための複数の構造タンパク質の同時発現を必要とするのVLPを産生する哺乳動物および昆虫細胞発現系を使用します。インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、デング熱ウイルス（DENV）、およびチクングニアウイルス（CHIKV）：私たちの仕事は、人間の病原体に対する設計、生産、および精製VLPに基づくワクチンに焦点を当てています。我々の方法は、複数の発現プラスミドからの複数の構造タンパク質、または単一の発現プラスミド（ 図1）の共発現を可能にするために十分に柔軟です。以前、我々は、製造および精製H5N1 VLPは、インフルエンザ赤血球凝集素（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、及びヒト胚性腎臓293T細胞におけるマトリックス（M1）5,6をコードするプラスミドとの共発現から組み立て。遺伝子は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化さpTR600、transcを開始するためのサイトメガロウイルス初期プロモータープラスイントロンAを含む真核細胞発現ベクターにクローニングしました。真核生物の挿入と転写7の終結のためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルのription。 HA、NA（ 図1A）および代替ウイルスマトリックスタンパク質、HIVのGag P55、の三プラスミドの同時発現を用いて同様のアプローチがこの研究にヒト季節性インフルエンザ亜型H3N2 VLPの生成に使用し、生成することが示されていますインフルエンザ粒子8と同様のサイズのVLPを。インフルエンザワクチンは、主に抗HA抗体を誘発するが、インフルエンザノイラミニダーゼの添加は、トランスフェクトされた細胞9も存在する追加の免疫原性標的から出芽VLPを可能にするためにシアリダーゼ活性を媒介します。 RSVのVLPを生成するために、我々はまた、先に説明し、電子顕微鏡6,10によって特徴付けられるように、さらに、HIVギャグを使用して、VLP形成の柔軟性を実証するために排他的にRSV表面糖タンパク質を提示原型ワクチンを設計するHIVのGagの無関係なコアを選択しました。他人以前それはRSV糖タンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）11、およびインフルエンザマトリックス12から種々のウイルス成分を用いて組み立てることができる提示するVLPを示しています。全長表面糖タンパク質配列は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を介して機能的受容体結合および抗体認識のアッセイのために必要とすることができる天然のコンホメーションを維持するために、この研究において使用しました。
粒子を生成するために単一のプラスミド発現系を使用するための私達の例としては、DENVおよびCHIKVあります。 DENVのケースでは、我々は、PRM / E構造遺伝子発現カセット13を含む単一プラスミドからの293T細胞における無カプシドとサブウイルス粒子（のSVP）を生成することができます。用語SVPは、ウイルス構造タンパク質のアセンブリにおいて、コアまたはカプシドタンパク質の欠如を示すために使用されます。 CHIK VLPはまた、カプシドおよびエンベロープタンパク質をコードする、またはIで、CHIKV構造遺伝子カセットを含む単一プラスミドを用いて製造することができます昆虫細胞発現（ – C 図1B）のために最適化された同じ構造遺伝子カセットをコードする組換えバキュロウイルスに感染させることによってnsect細胞。
上述の式アプローチの最終結果は、その後、20％のグリセロールクッションを介して超遠心によって精製することができる細胞培養培地中にVLPを放出します。本稿では、哺乳動物および昆虫細胞系からこれらのVLPを発現し、精製する方法を提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は成功し、様々な病原体のための複数の構造タンパク質で構成のSVPとのVLPを発現し、精製するために、上述の技術を使用しています。一般的に、我々は我々のVLPを生成するために、哺乳動物発現系を使用しています。しかし、私たちの手で、哺乳動物細胞は、CHIKのVLPの収量が低かった派生しました。組換えバキュロウイルス – 昆虫細胞系を使用する場合CHIKのVLP収率はより堅牢でした。?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、最大効率や歩留まりのためのプロトコルを最適化する助けたロスラボの前にメンバーを承認したいと思います。
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Referências
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability – how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- . Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- . Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. . Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
